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《中南大学》 2009年
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Prohibitin在胆固醇规律前列腺癌PC-3细胞周期作用研究

董培  
【摘要】: 前列腺癌(prostate cancer PCa)是威胁男性健康的常见肿瘤之一。在美国男性,前列腺癌是最常见的非上皮性肿瘤和第二位致死性的肿瘤。仅2006年就有234,460例新发病例,及将近30,000例死亡,占所有男性肿瘤的1/3。我国前列腺癌发病率也逐年升高,目前已位居男性泌尿系统恶性肿瘤第三位。由于前列腺位置隐蔽,临床症状不典型,就诊时患者往往已是失去前列腺根治手术指证晚期患者。对这些晚期患者治疗手段主要是通过药物或外科手术阻断雄激素疗法(ADT),然而,这些治疗方法却伴随着许多副作用,例如骨质疏松症和心血管疾病。ADT通常只能提供暂时的缓解,约30%患者会复发并更难治和更加恶性的疾病,进展为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)。 近年来研究表明,高脂肪/胆固醇等“西方饮食”同前列腺癌的发病和进展密切相关。高血清胆固醇水平能够促进前列腺癌的发展并且导致对于雄激素刺激上调,通过改变饮食及药物降低血清胆固醇水平将有助于减缓前列腺癌的进展。 我们的体外实验研究证实在低胆固醇水平条件下促进prohibitin(PHB)蛋白表达上调。基因序列同源分析证实了PHB多个位点和固醇调节元件SREs高度序列同源。SREs存在于胆固醇规律基因中,提示PHB可能对固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)活性敏感。PHB基因广泛存在于细胞核,细胞质和线粒体,是一种有效的肿瘤抑制基因,具有高度的保守性,因其具有明显的抗细胞增殖,抗肿瘤而得名。PHB基因的表达产物PHB蛋白的氨基酸结构非常保守,是一类新型的分子伴侣蛋白。PHB在规律细胞周期循环,介导信号传递,抗增殖、抗凋亡和抗衰老中发挥着非常重要的作用,但具体的分子机制尚未完全阐明。PHB是否是阻止前列腺癌细胞通过细胞循环转录的主要胆固醇敏感因子,以及在低胆固醇条件下是否是通过PHB上调作用抑制前列腺癌细胞增殖目前尚无相关报道。 本研究采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Real-time PCR、2DE Western-blot检测分别培养于普通培养基(NM)和胆固醇耗竭培养液(CDM)中的前列腺癌PC-3细胞中PHB的mRNA和蛋白水平变化;并进一步转染PHB启动基因到前列腺癌PC-3细胞中,采用免疫荧光检测在低胆固醇水平条件下,PHB表达是否增强;同时进行一系列基因片段切除,分离出约200bp胆固醇敏感启动元件,确定类似于SREs位点并进行点突变;进一步采用siRNA基因沉默PC-3中的PHB,确定在CDM条件下,是否抑制PHB表达将允许细胞继续转录通过细胞循环,从而论证在PC-3细胞中PHB是胆固醇敏感的细胞循环规律因子假说。初步揭示低胆固醇条件下通过上调PHB表达而抑制前列腺癌发展的分子机制,为治疗前列腺癌提供新的思路。 第一章不同胆固醇水平条件下人前列腺癌PC-3细胞中PHB表达及意义 目的: 研究比较分别培养于NM和CDM中人前列腺癌PC-3细胞PHB mRNA及蛋白的表达差异,分析胆固醇对PHB表达影响与前列腺癌发展关系。 方法: 以人前列腺癌PC-3细胞系为研究对象,分别培养于NM和CDM中。培养液加入/不加入血小板源性生长因子PDGF或EGF。显微镜下细胞计数,半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Real-time PCR检测PHB的mRNA变化。2-DE和Western-blot检测PHB蛋白。 结果: 1.培养于CDM的前列腺癌PC-3细胞数目明显少于培养于NM中细胞数目,给予PDGF或EGF到NM中显著促进PC-3细胞增殖,而加入CDM中则导致细胞死亡。两者表达显著性差异(p<0.05)。 2.培养于CDM中的PC-3细胞PHB mRNA表达显著高于培养于NM的细胞表达,两者有显著性差异(p<0.05)。 3.培养于CDM中的PC-3细胞PHB蛋白表达显著上调。 结论: 1.低胆固醇抑制前列腺癌PC-3细胞体外增殖。 2.低胆固醇促进前列腺癌PC-3细胞中PHB mRNA和PHB蛋白表达。 3.低胆固醇抑制前列腺癌PC-3细胞增殖和PHB表达上调有关。 第二章PHB启动子中胆固醇敏感作用位点研究 目的: 确定PHB启动子中对于胆固醇敏感的作用位点,探讨PHB是胆固醇敏感的细胞循环规律因子的分子机制。 方法: 转染荧光素酶报告基因载体PGL3和PHB启动子结合的荧光素报告质粒到PC-3细胞,分别培养于LPDS实验组和LPDS+CHO对照组中。Luciferase免疫荧光分析比较前列腺癌PC-3细胞中PHB表达差异;PCR扩增、分段切除PHB启动子,重复转染和Luciferase荧光表达检测,限定约200bp胆固醇敏感启动元件区域;找出该段区域中同源于SRE位点并进行点突变,证实PHB启动子中的胆固醇敏感调控位点同源于SRE。 结果: 1.Luciferase荧光检测结果显示,在完整的PHB启动子转染PPHB-1192组中,培养于LPDS中Luciferase荧光表达显著高于培养于LPDS+CHO,两者比较有显著性差异(p<0.05)。 2.同完整的PHB启动子转染PPHB-1192组比较,PPHB-179组luciferase荧光表达显著降低,两者有显著性差异(p<0.05)。PPHB-179中LPDS组和LPDS+CHO组Luciferase荧光表达无显著性差异(p>0.05)。 3.点突变位于PHB启动子上的-117到-108bp的SRE同源位点后,同PPHB-1192比较,SREMUT点突变组Luciferase荧光表达显著降低,两组比较有显著性差异(p<0.05)。SREMUT点突变中LPDS组和LPDS+CHO组Luciferase荧光表达无显著性差异(p>0.05)。 结论: 1.PHB表达受胆固醇调节。 2.PHB启动子中对胆固醇敏感的作用位点位于-117到-108bp区间。 3.PHB启动子对胆固醇敏感作用位点同源于SRE。 第三章PHB在人前列腺癌PC-3细胞中的作用机制研究 目的: 观察研究RNAi抑制前列腺癌PC-3细胞中的PHB表达对细胞增殖、凋亡影响,探讨PHB影响人前列腺癌进展的可能作用机制。 方法: SiRNA基因沉默PC-3细胞中PHB基因,Annexin V/PI双染和流式细胞计数观察NM和CDM培养下分别给予血小板源性生长因子PDGF或EGF刺激的前列腺癌凋亡细胞数目差别;四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)检测细胞增殖。 结果: 1.流式细胞检测发现,在siRNA抑制PC-3细胞中的PHB后,CDM实验组细胞凋亡率显著增加,同NM对照组比较有显著性差异(p<0.05);CDM组给予PDGF或EGF后,细胞凋亡率升高,与NM对照组相比较有显著性差异(p<0.05)。 2.MTT检测细胞增殖发现,在NM组内,给予PDGF或EGF刺激72小时后,同对照组Negative RNAi相比较,PHB RNAi实验组细胞增殖显著增加,两者比较有显著性差异(p<0.05)。同20 ng/ml PDGF或EGF相比较,给予40ng/mlPDGF或EGF刺激后,细胞增殖有增加趋势。在CDM组内,给予PDGF或EGF刺激72小时后,同对照组Negative RNAi相比较,实验组PHB RNAi细胞数目不增加反而显著减少,两者比较有显著性差异(p<0.05)。随着PDGF或EGF浓度升高,细胞增殖数目呈下降趋势。 结论: 1.低胆固醇下给予生长刺激因子诱导人前列腺PC-3细胞凋亡。 2.低胆固醇抑制前列腺癌PC-3细胞体外增殖活性可能同PHB表达上调有关。 3.PHB可作为前列腺癌基因治疗的一个靶点。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R737.25

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