收藏本站
《中南大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的恶性胶质瘤靶向联合基因治疗

谭泽明  
【摘要】: 第一章超顺磁性Fe_3O_4纳米颗粒基因转运体系建立及体外基因转运效率评价 目的:制备能够应用于胶质瘤靶向联合基因治疗的四氧化三铁磁性纳米颗粒,建立以超顺磁性Fe_3O_4磁性纳米颗粒为基因载体的胶质瘤基因治疗基因转运体系,并评价该体系的体外基因转运效率。 方法:以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮铁为原料,采用高温分解铁有机物法是将铁前驱体高温分解得到铁原子,再由铁原子生成铁纳米颗粒,将铁纳米颗粒控制氧化得到四氧化三铁纳米颗粒;再以偶联剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(NH_2C_3H_6Si(OC_2H_5)_3)对Fe_3O_4磁性纳米颗粒(Fe_3O_4magnetic nanoparticle,Fe_3O_4MNP)表面修饰;将CD基因转染U251胶质瘤细胞,得到U251-CD细胞,免疫荧光染色检测本体系的转染效率。通过Fe_3O_4MNP与质粒pCMVCD结合试验,Fe_3O_4MNP-pCMVCD复合物的DNase-Ⅰ消化,血清消化保护实验结果检测Fe_3O_4MNP结合DNA的能力及对DNA的保护效果。采用RT-PCR、Western blotting,和高效液相色谱法等检测CD基因的mRNA水平和CD蛋白水平,U251-CD细胞。MTT法测定检测U251-CD细胞的5-FC化疗效果及旁观者效应。 结果:成功地制备出稳定性好、单分散、粒径小、粒径分布范围窄(10±2nm)的磁性Fe_3O_4/氨基硅烷复合纳米颗粒,以γ-氨丙基三乙氧基硅烷作分散稳定剂,改善了磁性Fe_3O_4纳米颗粒表面的疏水环境,有效地阻止了四氧化三铁纳米颗粒团聚的发生。当Fe_3O_4MNP与质粒pCMVCD质量比为0.05:1时,结合的质粒量20%;当二者质量比为1:1时,几乎可以结合体系中的全部质粒。Fe_3O_4MNP-pCMVCD复合物能够保护质粒pCMVCD免受Dnase-Ⅰ及血清的消化作用,保持其结构稳定。使用Fe_3O_4MNP作为载体成功将CD基因成功转染U251细胞,转染细胞有CD基因稳定表达,呈时间相关性增强表达模式(转染后5天内呈现表达持续增加模式),转染效果明显优于脂质体转染对照组。Fe_3O_4MNP的转染效果与Fe_3O_4MNP的用量呈正相关,且无明显的细胞毒性,经MTT检测Fe_3O_4MNP在50mg/L以下时不影响U251细胞的生长曲线。U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,细胞培养液上清中,经高效液相色谱检测出U251-CD细胞生成的高浓度5-氟尿嘧啶。能显著的抑制U251细胞生长。U251与U251-CD混合细胞中,在加入5-FC(终浓度1000uml/L)后,10%的U251-CD细胞可以杀灭20~30%的U251与U251-CD混合细胞与对照组(0%组)相比P0.01,15%的U251-CD细胞可以杀灭约50%U251与U251-CD的混合细胞;30%的U251-CD细胞可以杀灭约80%U251与U251-CD的混合细胞;50%以上的U251-CD细胞可以完全的杀灭U251与U251-CD的混合细胞。 结论:本章制备的经γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe_3O_4磁性纳米颗粒粒径小,生物相容性提高,达到作为基因载体应用于胶质瘤靶向联合基因治疗要求。超顺磁性Fe_3O_4纳米颗粒基因转运体系在体外U251胶质瘤细胞系应用中转染效果显著。Fe_3O_4MNP/CD/5-FC胶质瘤基因治疗系统应用于胶瘤基因治疗体外试验抑瘤效果突出,可应用于下一步动物体内实验检测。 第二章Fe_3O_4MNP介导CD/5-FC系统联合wt-p53及wt-p16治疗恶性胶质瘤的体外实验研究 目的在第一章的Fe_3O_4MNP/CD/5-FC胶质瘤基因治疗系统成功研发的基础上,为优化该基因治疗系统,研发wt-p53、wt-p16基因联合胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase,CD)/5-FC系统治疗神经胶质瘤的可行性,以期能提高胶质瘤化疗效果及逆转胶质瘤干细胞对化疗药物产生多药耐药性。 方法分离培养并鉴定U251细胞系及30例临床胶质瘤病理标本(WHOⅢ级、Ⅳ级)的胶质胶干细胞。利用Fe_3O_4MNP为基因载体分别将质粒pCDNA3.1-p16、pYD5-p53,及pCMVCD转染至U251细胞、各组病理组织分离的胶质瘤细胞及其胶质瘤干细胞(Glioma stemcells,GSC)。采用RT-PCR、Western blotting检测目标基因转染后在相应的细胞中的表达情况。MTT法检测不同基因治疗方案的U251细胞及U251GSC细胞的对CD/5-FC的治疗敏感性;并检测四种临床常用化疗药物VM-26,VP-16,TMZ,5-FU对不同基因治疗方案的U251及U251GSC的生长抑制率。使用AnnexinV-PI双染法对10例病理标本分离出来的并经转染后的各组Ⅲ~Ⅳ级胶质瘤细胞实施不同的基因治疗方案后的细胞凋亡情况进行检测。 结果成功以Fe_3O_4MNP为载体将wt-p53、wt-p16,及CD基因转染U251细胞、30例病理标本分离出来胶质瘤细胞,及其胶质瘤干细胞,并稳定表达。RT-PCR、Western blotting检测结果显示胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的目标基因表达情况无差别(p0.01)。体外转染wt-p53、wt-p16基因都能明显提高CD/5-FC人对U251细胞系的化疗效果。以VM-26、VP16、TMZ,5-FU的1倍血浆峰浓度值的细胞增殖抑制率,各化疗药物组对U251胶质瘤细胞的体外增殖均有不同程度的抑制,以TMZ效果最好;但U251GCS对各种化疗敏感度均较U251细胞明显下降(p0.01),其中TMZ效果最好;P53/P16转染组U251GCS对VM-26、VP16、TMZ,5-FU的敏感性较U251GCS均明显提高(p0.01),TMZ效果仍是最好。对10例病理标本分离出来的并经转染后的各组Ⅲ~Ⅳ级胶质干瘤细胞实施不同的基因治疗方案后的细胞凋亡情况进行检测结果显示CD/P53/P16联合组胶质干瘤细胞凋亡率(46.32±12.78%)高于对照组(1.53±1.22%)及P53(30.1±10.45%)、P16(33.10±9.89%)单独转染组(p0.01)。CD/P53/P16/5-FC组(89.87±9.02%)明显高于CD/P53/P16/5-FU组(60.18±6.23%)(p0.01)。 结论基于Fe_3O_4磁性纳米基因载体的p53、p16联合CD/5-FC系统基因治疗体系可作为临床上胶质瘤治疗方案的一种可能选择,可在体外有效的杀灭胶质瘤细胞及胶质瘤干细胞,该基因治疗系统对肿瘤细胞杀伤作用的机理与凋亡相关。另外,该体系能逆转胶质瘤干细胞对多种临床常用的化疗药物的耐药性,明显提高化疗效果。 第三章Fe_3O_4 MNP介导CD/5-FC系统联合wt-p53及wt-p16治疗恶性胶质瘤的动物实验研究 目的Fe_3O_4磁性纳米基因载体在体内的转染效果及静脉注射时体内分布情况。在胶质瘤干细胞裸鼠皮下成瘤动物模型中验证本课题研发的“基于Fe_3O_4磁性纳米基因载体的p53、p16联合CD/5-FC系统基因治疗体系”的治疗效果。实施体内磁靶向定位基因治疗,并观察该基因治疗体系的全身副作用。 方法建立胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型。原子吸收分光光度计检测Fe_3O_4MNP在裸鼠体内的磁靶向定位效果及体内分布情况。免疫组化检测各目标基因的蛋白在动物模型胶质瘤组织中的表达,并采用TUNEL原位凋亡试剂盒检测各组肿瘤组织细胞凋亡情况。效液相色谱法检测5-FC体内转化为5-FU情况。体内抑瘤实验检测不同基因治疗方案下各组胶质瘤干细胞在裸鼠皮下成瘤体积,计算抑瘤率,评定治疗效果,并观察裸鼠体重的变化。对比CD/P53/P16转染组5-FC与5-FU的治疗效果及全向副作用。 结果成功建立胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型,一般在接种后14d可见较明显皮下结节的形成。在体外肿瘤表面施加4000高斯磁场时,鼠尾静脉注射磁性纳米颗粒溶液后45min,实验组的肿瘤组织铁元素含量(μg/g)为91.46±19.94,远高于对照组30.23±6.34,(p0.01)。说明在磁场作用下Fe_3O_4MNP定向向肿瘤组织移动,大量聚集在肿瘤组织内造成铁元素含量明显升高,另外脑组织铁含量也较正常对照组明显升高(p0.01),说明Fe_3O_4MNP透过血脑屏障能力显著。wt-p53、wt-p16能够显著的裸鼠荷瘤的体积,并减少荷瘤裸鼠体重的下降。荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FC后5d起皮下肿瘤体积明显缩小,经高效液相色谱对肿瘤组织均浆检测出5-FU。而荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FU后1M内肿瘤体积末见缩小,反而进行性恶化。5-FC治疗组对裸鼠骨髓抑制、血常规、肝功能影响明显小于5-FU治疗组(p0.01)。各组荷瘤裸鼠TUNEL检测凋亡情况结果与第二章体外检测结果一致。对12例不同的胶质瘤病理组织分离培养的胶质瘤干细胞裸鼠皮下形成的胶质瘤行体内Fe_3O_4MNP介导的CD/p53/p16基因治疗。12例中原病理组织P53,P16免疫组化阳性率均为25%,基因治疗总有效率为33%(4/12),微效率为25%(3/12),无效率为25%(3/12),恶化率为17%(1/12)。 结论基于Fe_3O_4磁性纳米基因载体的p53、p16联合CD/5-FC系统基因治疗体系可作为临床上胶质瘤治疗方案的一种可能选择,可在胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型体内有效抑制胶质瘤生长,在5-FC治疗时能有效的缩小已生成胶质瘤体积,该基因治疗系统对肿瘤细胞杀伤作用的机理与凋亡相关,体内外实验结果相符。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R739.4

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘清流;张峰;;稳定整合靶向EGFL7基因的shRNA载体的胶质瘤细胞系的建立[J];中国医药科学;2011年09期
2 宗黎琼,沈炜明;肿瘤基因治疗浅谈[J];国外医药.抗生素分册;1996年04期
3 甘润良,杨永宗;肿瘤基因治疗的临床应用前景[J];中国普通外科杂志;1996年05期
4 沈德钧;郑树;;肿瘤基因治疗研究进展[J];医学分子生物学杂志;1992年06期
5 刘洁;肿瘤基因治疗的最新途径[J];生理科学进展;1994年02期
6 田志刚;刘杰;;肿瘤基因治疗的原理及应用[J];国际肿瘤学杂志;1992年06期
7 俞红,黄辉;肿瘤基因治疗的新进展[J];上海免疫学杂志;1995年03期
8 曹雪涛;第三届国际肿瘤基因治疗会议简介[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1995年01期
9 赵亚刚;肿瘤基因治疗的方法及现状[J];河南肿瘤学杂志;1996年02期
10 夏仁品;肿瘤基因治疗[J];中国普外基础与临床杂志;1998年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 潘冬生;;多基因修饰胶质瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年
2 林李家宓;黄君健;黄翠芬;孔祥复;;生物治疗-肿瘤基因治疗[A];首届国际生物经济高层论坛摘要集[C];2005年
3 张泽舜;仇志坤;崔磊;陈芙蓉;韩富;陈忠平;;双氢青蒿素诱导胶质瘤细胞自噬并提高替莫唑胺抗胶质瘤活性[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年
4 张泽舜;仇志坤;崔磊;陈芙蓉;韩富;陈忠平;;双氢青蒿素诱导胶质瘤细胞自噬并提高替莫唑胺抗胶质瘤活性[A];第八届亚洲神经肿瘤学术大会(8th ASNO Meeting)论文集[C];2011年
5 张涛;王占祥;陈玉英;;MicroRNA与胶质瘤研究进展[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年
6 董雪涛;杨学军;王华民;王维;李瑜;张斌;于圣平;名浩朗;;hMena在胶质瘤中的表达及分布特征[A];第八届亚洲神经肿瘤学术大会(8th ASNO Meeting)论文集[C];2011年
7 王莹;综述;雷霆;牛洪泉;万峰;审校;;脑胶质瘤干细胞与DC介导的抗胶质瘤免疫治疗[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年
8 王颖毅;张军霞;孙关;王协锋;孙利华;浦佩玉;康春生;刘宁;傅震;尤永平;;STAT3介导反义miR-21调控hTERT的表达调节胶质瘤细胞生长[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
9 施炜;崔大明;王中;施金龙;倪兰春;鞠少卿;周幽心;吕成林;陈建;;胶质瘤中Hedgehog/Gli1信号通路活性变化与VEGF基因表达的关系[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年
10 陈骅;黄强;;敲低CDC2表达可以抑制胶质瘤细胞增殖[A];苏州市自然科学优秀学术论文汇编(2008-2009)[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 匡远深;让胶质瘤干细胞不再“繁殖”[N];健康报;2011年
2 孔为民;肿瘤基因治疗研究进展[N];中国中医药报;2002年
3 衣晓峰 冯宇曦;中药三氧化二砷有望成为治疗胶质瘤新药[N];中国医药报;2011年
4 马飞;肿瘤基因治疗仍在探索阶段[N];健康报;2001年
5 万同己;P53基因与肿瘤基因治疗[N];中国医药报;2004年
6 马丁 周剑峰;肿瘤基因相关治疗发展迅速[N];中国中医药报;2003年
7 北京大学人民医院血液病研究所博士 黄晓军;“幸子”的希望之光[N];健康报;2000年
8 张中桥;NDRG2可诱导肝癌细胞HepG2凋亡[N];中国医药报;2004年
9 杨霞;新方法治疗脑胶质瘤[N];保健时报;2003年
10 杨霞;光敏分子激光靶向治疗脑胶质瘤[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 谭泽明;基于超顺磁性四氧化三铁磁性纳米颗粒的恶性胶质瘤靶向联合基因治疗[D];中南大学;2009年
2 栾世海;MiRNA-126和miRNA-34a在胶质瘤细胞中功能的实验研究[D];复旦大学;2010年
3 李丹;胶质瘤不同病理级别差异miRNA/mRNA动态表达谱构建及其对接研究[D];中南大学;2010年
4 张所军;神经干细胞向胶质瘤干细胞迁移及对其生长特性的影响[D];华中科技大学;2011年
5 苏静;抑制细胞内氯通道对胶质瘤肿瘤生物学特性影响的研究[D];吉林大学;2010年
6 陶帮宝;Stathmin在胶质细胞瘤表达及其化疗药物敏感性研究[D];第二军医大学;2011年
7 于天浩;蛋白酶体抑制剂MG-132治疗胶质瘤的实验研究[D];吉林大学;2008年
8 李巧玉;神经生长因子在人脑胶质瘤中的表达特点及其临床意义[D];江苏大学;2011年
9 王春辉;格尔德霉素治疗脑胶质瘤及其与肝细胞生长因子相关性研究[D];吉林大学;2009年
10 王海峰;抑制蛋白酶体功能对脑胶质瘤作用的实验研究[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孟葳;3.0TMRI弥散张量成像在脑肿瘤诊断及胶质瘤分级诊断的价值研究[D];广西医科大学;2010年
2 陈宝敏;胶质瘤干细胞生物学特性比较及放射耐受机制的初步研究[D];苏州大学;2010年
3 杨生军;~(11)C-蛋氨酸PET/CT及整合素β1表达与胶质瘤生物学行为的相关性研究[D];昆明医学院;2011年
4 徐海芳;神经胶质瘤Wnt信号通路抑制基因甲基化调控研究[D];河南大学;2010年
5 张栋梁;LY294002靶向抑制PI3K/AKT信号转导通路干预胶质瘤细胞生长的研究[D];河北大学;2011年
6 陈亮;CD82/KAI1和CD9/MRP-1在神经胶质瘤细胞株中的表达及表达意义的初步研究[D];重庆医科大学;2010年
7 曹栓柱;Per1、Per2在体外培养的胶质瘤细胞和正常细胞中的表达的差异性研究[D];宁夏医科大学;2010年
8 高吉国;候选肿瘤抑制基因ECRG4抑制胶质瘤增殖及侵袭的研究[D];吉林大学;2011年
9 薛进展;Rho/ROCK通路对人U87胶质瘤细胞侵润转移能力调节作用的体外实验研究[D];河南科技大学;2011年
10 魏盈胜;WIF-1基因在人脑胶质瘤中的表达及意义[D];中南大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026