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《中南大学》 2009年
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不同浓度嗜酸乳酸杆菌对急性实验性结肠炎的疗效和对近、远端结肠菌群的影响及其治疗机制研究

陈琳琳  
【摘要】: 第一章不同浓度嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎的疗效 目的:通过比较不同浓度嗜酸乳酸杆菌治疗实验性结肠炎的疗效,寻找治疗实验性结肠炎适宜的嗜酸乳酸杆菌浓度。 方法:实验用Balb/c小鼠72只,雌性,6-8周龄,体重20.0±2.0克,购于湖南农业大学东创实验动物科技服务部,饲养于清洁级动物房,随机分成9组,每组8只,饲养于标准条件下(湿度50%±10%;12h白昼/12h黑夜轮换),喂食普通小鼠饲料。分组情况如下:(1)模型组:饮用5%DSS造模;(2)生理盐水组:5%DSS造模+NS(1ml/10g)灌胃(3)(C4组):5%DSS造模+1×10~4CFU/10g嗜酸乳酸杆菌灌胃;(4)(C5组):5%DSS造模+1×10~5CFU/10g嗜酸乳酸杆菌灌胃;(5)(C6组):5%DSS造模+1×10~6CFU/10g嗜酸乳酸杆菌灌胃;(6)(C7组):5%DSS造模+1×10~7CFU/10g嗜酸乳酸杆菌灌胃;(7)(C8组):5%DSS造模+1×10~8CFU/10g嗜酸乳酸杆菌灌胃;(8)醋酸泼尼松组:5%DSS造模+醋酸泼尼松(45ug/10g)灌胃;(9)正常组:正常饮食,无特殊处理。实验期间每日观察小鼠进食、饮水、活动等一般情况,称量体重,观察粪便性状及粪便隐血、便血情况,计算DAI积分,评估结肠炎严重程度。实验第7天,乙醚麻醉状态下处死小鼠,解剖腹腔,观察结肠的大体改变、测量长度。于结肠距回盲部1cm处和肛门1cm处各剪取0.5cm长的结肠用于细菌分析,另取肛门附近结肠组织长度约0.5cm于中性福尔马林中固定,石蜡包埋切片HE染色,其余结肠液氮保存以备它用。 结果:中等浓度的嗜酸乳酸杆菌干预组C6(10~6CFU/ml浓度级)组小鼠实验性结肠炎症状缓解最明显,DAI评分及组织损伤评分最低。 结论:嗜酸乳酸杆菌治疗实验性结肠炎有一定的量效关系,然而并非完全正相关,中等浓度(10~6CFU/ml浓度级)组疗效最佳。 第二章嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠模型结肠近、远端细菌的影响 目的:研究实验性结肠炎模型鼠经不同浓度的嗜酸乳酸杆菌治疗后近、远端肠道菌群的改变 方法:实验动物、分组、模型建立及给药方案与第一章相同,于实验第7天,乙醚麻醉状态下处死小鼠,解剖腹腔,在结肠距回盲部1cm处和肛门1cm处各剪取0.5cm长的结肠,称量后灭菌匀浆器匀浆,用灭菌NS按梯度稀释法稀释,选择7种选择性培养基分析肠道菌群具有代表性的厌氧菌3种(乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌),需氧菌3种(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌)及总需氧菌。根据各菌菌落形态特征、革兰染色及光镜下特征进行初步鉴定。对厌氧菌(双歧杆菌及乳酸杆菌)和肠球菌培养分离取得纯菌后,采用API试验条接种后读取结果,用数字图谱判定鉴定结果 结果:各实验组近端结肠由7种选择性与非选择性培养基培养的细菌数无明显差别,远端结肠醋酸泼尼松组小鼠各种细菌特征与DSS造模组类似,各嗜酸乳酸杆菌干预组以C6(10~6CFU/ml浓度级)组小鼠的益生菌(乳酸杆菌和双歧杆菌)数量最多,与其余各组比较有显著差异(p<0.05),致病菌(金黄色葡萄球菌)最低与其余各组比较有显著差异(p<0.05),其它选择性培养基的细菌数无明显差别。 结论: 1.嗜酸乳酸杆菌不定植于近端结肠,对近端结肠菌群无影响。 2.嗜酸乳酸杆菌能定植于远端结肠,对远端结肠菌群有影响,增加益生菌(乳酸杆菌、双歧杆菌)的生长,抑制致病菌(金黄色葡萄球菌)生长,以10~6CFU/ml浓度级组作用最明显。 第三章嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠模型Th17/IL23免疫轴的影响 目的:探讨不同浓度的嗜酸乳酸杆菌对实验性结肠炎模型鼠起治疗作用的免疫学机制。研究嗜酸性乳酸杆菌对与IBD发病密切相关的Th17/IL23免疫轴主要相关细胞因子和信号因子:IL17、IL23、TGFB,TNFa、STAT3和P-STAT3的影响,为进一步探索嗜酸乳酸杆菌治疗实验性结肠炎机制以及用量提供帮助。 方法:实验动物、分组、模型建立及给药方案与第一章相同,在实验结束时处死动物留取各组结肠标本,行western blotting和RT-PCR技术检测小鼠结肠黏膜内细胞因子IL17、IL23、TGFB、TNFa及信号因子STAT3和P-STAT3的表达量,以及免疫组化检测信号因子STAT3,P-STAT3在结肠组织的表达部位及表达量。 结果:各项指标的mRNA水平和蛋白质水平显示:均为模型组最高,NS组次之,醋酸泼尼松组较模型组有明显降低。 对于不同浓度的嗜酸乳酸杆菌组,结果显示:Th17细胞分化相关的细胞因子(IL23、TGFB)以10~5CFU/mL组表达量最低,且效果优于醋酸泼尼松组(p<0.05)。Th17细胞分化相关的信号因子(STAT3,p-STAT3),以10~5CFU/mL、10~6CFU/mL组表达量最低,效果优于醋酸泼尼松组(p<0.05),其中STAT3的检测中RT-PCR和免疫组化方法检测结果显示10~6CFU/mL组检测量最低,10~5CFU/mL、10~4CFU/mL、10~7CFU/mL组次之,优于醋酸泼尼松组(p<0.05);WB方法显示10~5CFU/mL组检测量最低,10~6CFU/mL、10~4CFU/mL、10~7CFU/mL组次之,优于醋酸泼尼松组(p<0.05)。关于p-STAT3表达的蛋白质水平比较结果显示:嗜酸乳酸杆菌干预组中免疫组化方法检测结果显示10~6CFU/mL组检测量最低,10~5CFU/mL、10~7CFU/mL组次之,且10~6CFU/mL、10~5CFU/mL均较醋酸泼尼松组低(p<0.05);WB方法显示10~5CFU/mL组检测量最低,10~6CFU/mL、10~4CFU/mL、10~7CFU/mL组次之,且均较醋酸泼尼松组低(p<0.05)。Th17细胞产生的与机体免疫损伤和实验性结肠炎形成相关的促炎因子(IL17、TNFa)以10~5CFU/mL组IL17表达量最低,10~6CFU/mL组TNFa表达量最低。 结论: 1.嗜酸乳酸杆菌干预组的Th17分化相关细胞因子(IL23、TGFB),Th17分化相关信号因子(STAT3、p-STAT3)及实验性结肠炎形成相关的致炎因子(IL17、TNFa)表达量均有降低,与小鼠炎症缓解程度相符,10~6CFU/mL组效果最明显。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R574.62

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