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《中南大学》 2009年
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马兜铃酸与DNA相互作用的研究

高海燕  
【摘要】: 马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)是一种肾毒性物质,具有致癌性及致突变性。马兜铃酸在体内或体外被代谢激活后,与DNA共价结合生成马兜铃酸-DNA加合物(AA-DNA),这是AA致癌及致突变的主要机制。作为AA暴露的生物标志物,AA-DNA加合物的研究具有非常重要的意义。然而,目前市场上尚无AA-DNA加合物的标准品,开展对其深入研究技术上存在许多难点。因此非常有必要建立一种方便、快捷制备AA-DNA加合物标准品的方法。 本论文采用体外化学活化法用AA直接与脱氧核苷反应合成AA-DNA加合物,进而用固相萃取进行样品前处理,采用液相色谱进一步纯化,制备出了高纯度的AA-DNA加合物标准品(>94%)。AA-DNA加合物的分析鉴定采用LC-DAD-FL及LC-ESI-Q-TOF-MS/MS的方法,对四种加合物(dA-AAI、dG-AAI、dA-AAII及dG-AAII)的色谱、质谱以及碎片形成模式进行了分析,为后续的AA-DNA加合物的研究工作奠定了基础。 作为AA暴露的生物标志物,AA-DNA加合物的检测分析对于深入研究AA的致癌及致突变性具有十分重要的意义。本论文发展了一种高灵敏、高特异性地同时检测三种AA-DNA加合物(dA-AAI、dG-AAI及dA-AAII)的方法—LC-荧光法(LC-FL)。为了得到高效快速的分离,我们使用HALO C18柱,在25%乙腈条件下三种加合物能够在5min内即得到完全的基线分离,在普通的液相色谱仪器上得到超高效液相色谱(UPLC)的分离速度和效果,大大提高了复杂产物的分离度。在优化得到的色谱及荧光检测条件下,三种加合物均呈现出很好的线性相关性(r>0.9980),检测限分别是:dG-AAI:11.75fmol;dA-AAII:0.32 fmol;dA-AAI:0.23 fmol。此外,我们对三种加合物的保留时间及峰面积进行了精密度考察,三种加合物均呈现出良好的日内及日间精密度。 为了探讨马兜铃酸对机体的化学损伤机制,在国内外现有研究的基础上,我们采用体外暴露的方式及发展的LC-FL法对经AA暴露的小牛胸腺DNA及体外培养的人肺癌细胞DNA损伤作用进行了研究。在AA暴露的CT-DNA中,三种加合物的水平分别是:dG-AAI:9.5个加合物/10~3个正常碱基,dA-AAI:5.0个加合物/10~3个正常碱基,dA-AAII:6.0个加合物/10~3个正常碱基。而在AAI对人肺癌细胞(A549)的损伤作用研究中,我们考察了AAI毒性作用的时间-效应关系及剂量-效应关系,结果显示随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加,加合物的量成上升趋势。 综上所述,本论文发展的化学活化法合成、固相萃取纯化及液相色谱制备加合物的方法具有简便、快捷的优点,能够得到纯度很高的加合物标准品。而LC-FL方法检测AA-DNA加合物具有高灵敏、高特异性以及重现性好的优点,为AA-DNA加合物的研究提供了一种有力的手段,有望用于动物模型及人体内AA-DNA加合物的鉴定分析,对于临床疾病的防治工作具有重要意义。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q523

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【参考文献】
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