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《中南大学》 2010年
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DDAH1和ALDH2基因多态性与高血压及冠心病易感性的关联关系及机制研究

郭亦杰  
【摘要】: 研究背景 原发性高血压或高血压病由于其高发病率和高死亡率,是目前影响人类健康的主要常见疾病之一。大量的研究业已证实,高血压病是由环境与遗传因素共同作用所致的多基因疾病。 血管内皮在维持心血管系统的稳态中发挥极其重要的作用,内皮功能受损是包括高血压病在内的多种心血管疾病的早期表现和共同的病理生理特征。NO是维持血管内皮功能最重要的一种介质之一,由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化作用下生成,具有血管舒张作用。 非对称二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种内源性NOS抑制剂,能竞争性地抑制NO的生成。人体内生成的ADMA 80%经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(包括DDAH1和DDAH2两种亚型)水解代谢而失活。因此,体内DDAH酶活性的高低可通过影响ADMA的代谢,从而影响NOS的活性和NO的水平。遗传因素可能是影响体内DDAH酶活性的因素之一。由遗传因素所导致的个体间DDAH酶活性的差异可能通过影响ADMA的体内浓度,从而影响机体对高血压病的易感性。本文通过病例-对照研究,探讨DDAH1基因多态性与中国汉族人群高血压病遗传易感性的关系。 方法 1.候选单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点的选择与基因分型 应用NCBI数据库中的数据资源,对中国人群DDAH1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)进行登记,通过连锁不平衡分析,明确该基因区域SNP位点间的连锁不平衡情况,选择待分型的标签SNP (haplotype tag SNP, htSNP)。同时,随机选取20个无亲缘关系的高血压患者,通过PCR产物测序,对该基因所有外显子、外显子-内含子交界以及2kb范围内的启动子区进行重新测序和SNP发掘,寻找新的标签SNP。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,在1318例原发性高血压患者和1005例健康人群中对DDAH1基因的标签SNP进行基因分型,并通过应用高效液相色谱-质谱联用法测定病例和对照人群血浆ADMA的水平。 2.荧光素酶报告基因实验对SNP的功能进行验证 对于3’端未翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)出现阳性关联的SNP, PCR扩增含不同等位基因的3'-UTR区段并克隆入荧光素酶报告基因质粒,以pRL-SV40载体为内参,两种质粒混合并转染人脐静脉内皮细胞株HUVECs。双荧光素酶报告实验体系测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3'-UTR序列的转录活性。 3.培养的人脐静脉内皮细胞观察SNP的功能 分离和培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs), PCR-RFLP对脐静脉组织DDAH1 SNP位点进行基因分型,第4代内皮细胞于24孔板中培养24小时,ELISA法测定细胞内及培养基中ADMA的浓度和DDAH1的活性;应用放线菌酮处理内皮细胞,测定药物处理前(0小时)及药物处理后4、8、12、16、24和36小时DDAHl mRNA表达水平,比较DDAH1不同基因型个体HUVECs DDAH活性、ADMA水平、DDAH1 mRNA表达水平及半衰期的异同。 结果 (1)通过在20个无关中国个体中对DDAH1基因进行重新测序,总共发现了46个SNP,其中有10个为新发现的SNP。所有的46个SNP均不改变DDAH1的氨基酸结构,其中12个位于3'-UTR区。 (2)病例和对照人群中rs233113 A/T、rs3087894 C/G和rs233112A/G多态性位点基因型分布存在显著的差异(P值分别为0.003、0.003和0.042),且rs3087894 C/G和rs233113 A/T多态性呈完全连锁不平衡(D'=1,r2=1);病例和对照人群中rs3813600 C/T多态位点基因型分布差异不明显(p=0.073)。 (3)通过对高血压的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs233113 T(或rs3087894 G)等位的个体患原发性高血压病的风险显著降低(比值比=0.747,95%可信区间:0.618-0.904,P=0.005); rs233112GG基因型也可降低高血压病的发病风险(比值比=0.772;95%可信区间:0.607-0.983,p=0.035);而rs3813600多态位点与高血压病的发病风险不相关(p0.05)。 (4)病例组人群血浆ADMA的浓度显著高于对照人群组(p0.001)。在对照人群中,携带rs233113 T等位的个体血浆中ADMA浓度显著高于基因型为AA的个体(p=0.016),而在病例人群中,rs233113 TT基因型个体血浆ADMA浓度与rs233113 AA基因型个体相比有降低的趋势(p=0.089);对照组中携带rs3813600 T等位的个体血浆ADMA的浓度显著低于该位点基因型为CC的个体(p=0.033),rs233112GG基因型个体血浆ADMA的浓度显著高于该位点为AA基因型的个体(p=0.007);而在病例组中,rs3813600位点携带T等位的个体血浆ADMA的浓度显著高于该位点为CC基因型的个体(p=0.048); rs233112GG基因型个体血浆ADMA的浓度显著低于该位点为AA基因型的个体(p=0.036)。 (5)携带rs233113 T等位的pGL3质粒荧光素酶活性显著高于携带rs233113 A等位的质粒;与rs233113 (A/T)多态性呈完全连锁不平衡的SNP rs3087894 (C/G)/rs233115 (C/T)/rs233114 (A/C)构成的两种单倍型(rs3087894C-rs233115C-rs233114A和rs3087894G-rs233115T-rs233114C)间报告基因的活性无显著差别。 (6)携带rs233113 T等位的HUVECs (n=4)细胞内DDAH的活性显著高于基因型为rs233113 AA的HUVECs (n=5, p=0.039),而细胞内ADMA的浓度显著低于rs233113 AA基因型HUVECs(p=0.037)。放线菌酮处理前及处理后4小时和8小时,携带rs233113T等位的HUVECs (n=4)内DDAH1 mRNA表达水平显著高于基因型为rs233113 AA的HUVECs (n=5,p0.05)。与基因型为rs233113AA的HUVECs (n=5)相比,携带rs233113 T等位的HUVECs (n=4)内DDAH1 mRNA消除半衰期有缩短的趋势(t1/2分别为17.3±3.4h和51.0±31.5h,p=0.073)。 结论 DDAH1基因rs233113A/T和rs233112A/G多态性与中国长沙地区汉族人群原发性高血压的遗传易感性相关,rs233113A/T多态性可通过增加报告基因的活性、DDAH1 mRNA表达和活性,从而降低体内ADMA的水平,降低原发性高血压的易感性。 研究背景 冠心病是人类死亡的主要原因并已成为世界主要卫生问题之一。流行病学调查资料表明,冠心病是由环境因素和遗传因素相互作用所导致的多基因疾病。 血管内皮在维持心血管系统的稳态中起极其重要的作用,内皮功能受损是包括冠心病在内的多种心血管疾病的早期表现。NO能够调控内皮功能且能反映内皮功能的健康状况,其生成减少或活性降低在动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)和冠心病的发生发展中起到关键作用。 非对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种内源性NOS抑制剂,能竞争性的抑制NO的生成。研究表明,血浆ADMA水平和冠心病病变程度间呈强关联。此外,冠心病患者体内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平显著增加,氧化应激在AS和冠心病的发生发展中起重要作用。研究表明,病理生理浓度的ADMA也可通过增加培养的人脐静脉内皮细胞和脂肪细胞细胞内ROS的生成,从而参与AS的发生发展。 人体血浆中的ADMA主要经二甲基精氨酸二甲胺水解酶1和2(Dimethylarginine Dimethylaminohydrolases, DDAH1和DDAH2)水解代谢而失活。研究表明,遗传因素可能是影响体内DDAH酶活性的因素之一。因此,由遗传因素所导致的个体间DDAH酶活性的差异可能通过影响ADMA的体内浓度以及NO的水平,从而影响机体对冠心病的易感性。本文通过病例-对照研究,探讨DDAH1基因多态性与中国汉族人群冠心病遗传易感性的关系。 方法 1.病例对照标本候选SNP位点基因分型 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,在544例冠心病患者和992例健康对照人群中对DDAH1基因的标签SNP进行基因分型。 2.荧光素酶报告基因实验对SNP的功能进行验证 PCR扩增含不同等位基因的3’-UTR区段并克隆入pGL3-Control质粒中,以pRL-SV40载体为内参,两种质粒以及microRNA 218(miR-218)模拟物共同转染人脐静脉内皮细胞株HUVECs。双荧光素酶报告实验测定荧光素酶活性,分析和比较含不同等位的3’-UTR序列在不同浓度的miR-218模拟物处理下的报告基因活性。 结果 (1)冠心病病例组和对照组中rs233113位点AA、AT和TT基因型频率分别为53.5%、37.1%、9.4%和47.3%、43.3%、9.4%,病例组rs233113 AA基因型频率显著高于对照组(P=0.020)。病例组和对照组中rs233112位点AA、AG和GG基因型频率分别为32.8%、50.6%、16.6%和28.9%、49.9%、21.2%,病例组rs233112GG基因型频率显著低于对照组(P=0.036)。 (2)通过对冠心病的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs233113 T等位的个体患冠心病的风险显著降低(OR=0.503,95%CI:0.316-0.801, P=0.004),而携带rs233112 A等位的个体患冠心病的风险显著增加(OR=1.969,95%CI:1.040-3.728,P=0.037)。 (3)冠心病病例组人群血浆ADMA的浓度显著高于对照人群组(p0.05);病例组携带rs233113 T等位的个体血浆中ADMA浓度略低于AA基因型个体;携带rs233112 G等位的个体血浆中ADMA浓度显著低于基因型为AA的个体(p=0.024)。 (4)携带rs233112 A等位的质粒的荧光素酶活性显著高于携带rs233112 G等位的质粒(p0.05), miR-218 (2.5nM-20nM)可显著降低含rs233112 A质粒的荧光素酶活性,而对携带rs233112 G等位的质粒荧光素酶活性无影响。 结论 DDAH1基因rs233113A/T多态性和rs233112A/G多态性可分别降低和增加中国长沙地区汉族人群冠心病的发病风险,rs233112多态位点可影响报告基因活性和miR-218的结合,可能是影响冠心病易感性的功能性SNP位点。 研究背景 冠心病是一种由环境因素和遗传因素相互作用所导致的复杂性多因素疾病。大量的研究结果表明,氧化应激和活性氧(ROS)在动脉粥样硬化(AS)及其并发症的发生发展中起到重要作用。ROS可导致多种活性醛如4-羟基壬烯醛(4-HNE)等生成增加,而活性醛类可进一步加重氧化应激,引起血管内皮功能障碍,促进AS的病理生理过程。 人类线粒体醛脱氢酶(ALDH2)参与多种活性醛类的代谢灭活,其中包括4-HNE。ALDH2基因的第12号外显子上存在功能性单核苷酸序列多态性rs671多态,该SNP使ALDH2多肽第504位的谷氨酸被赖氨酸取代,从而导致ALDH2酶活性降低,代谢乙醛等活性醛的能力下降。 非对称二甲基精氨酸(ADMA)是一种内源性的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,它能够降低NO的生物利用度而导致内皮功能障碍,因此ADMA被视为一种新的冠心病和AS的危险因子。ADMA在体内主要是由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1和DDAH2)代谢灭活。在培养的内皮细胞中,4-HNE能通过与DDAH1形成Michael加合物而剂量依赖性地抑制]DDAH1活性,进而增加ADMA产生并降低NO生成。 本实验在中国人群中研究了ALDH2 rs671多态性是否与冠心病发病风险相关,并研究该多态是否可影响DDAH1的mRNA表达和ADMA的浓度,从DDAH/ADMA系统探讨其影响冠心病易感性的可能机制。 方法 1.病例对照标本候选SNP位点基因分型 收集冠心病和性别年龄相匹配的健康对照人群血液标本。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,对所有病例和对照人群ALDH2基因rs671多态性进行基因分型。 2. ALDH2 rs671多态性对原代人脐静脉内皮细胞血管紧张素Ⅱ处理前后DDAH1/ADMA系统的影响 取11根人脐带进行ALDH2基因分型,分离培养人脐静脉内皮细胞HUVECs。第4代细胞用不同浓度(10-7至10-5mol/L)的血管紧张素Ⅱ处理24小时。应用实时定量PCR法检测细胞内DDAH1 mRNA表达水平。应用高效液相色谱-质谱联用法检测细胞内及培养基中ADMA的水平。 结果 (1)冠心病病例组和对照组中rs671位点GG、GA和AA基因型频率分别为52.5%、41.0%、6.5%和65.0%、30.1%、4.9%,病例组rs671 GA+AA基因型频率显著高于对照组(χ2=13.807,P=0.0002)。通过对冠心病风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,在总人群中,携带rs671 A等位的个体患冠心病的风险显著增高(OR=1.85,95%CI:1.38-2.49,P=0.00005)。 (2)在病例和对照人群中,不饮酒人群携带rs671 A等位个体的频率均显著高于饮酒人群(病例组中分别为53.7%和28.8%,P=1.1×10-5;对照组中分别为38.8%和22.5%,P=0.003);不饮酒人群中病例组携带rs671 A等位个体的频率(53.7%)显著高于对照组人群(38.8%,P=0.00012)。通过对冠心病的风险因素进行校正,Logistic回归分析结果显示,携带rs671 A等位可显著增加不饮酒人群冠心病的发病风险(OR=1.95,95%CI:1.40-2.70, P=0.00007),但不影响饮酒人群冠心病的发病风险(OR= 1.56,95%CI:0.77-3.18, P=0.22)。 (3)在不饮酒健康人群,rs671 AA纯合子个体血清高密度脂蛋白(HDL-C)浓度(1.20±0.22 mmol/L, n=22)显著低于GG纯合子个体(1.39±0.36 mmol/L, n=212, P=0.015)。 (4)基因型为rs671 GG的HUVECs (n=6) DDAH1 mRNA表达水平显著高于基因型为rs671 GA的HUVECs (n=5) (p<0.05),而细胞内ADMA水平显著低于基因型为GA的HUVECs (p<0.05)。高浓度的血管紧张素Ⅱ(10-5mol/L)可显著降低基因型为rs671 GG的HUVECs中DDAH1 mRNA表达,升高该基因型HUVECs细胞内ADMA浓度,但对基因型为GA的HUVECs DDAH1 mRNA表达和ADMA浓度影响不明显(p0.05)。 结论 ALDH2基因rs671多态性可能通过降低HDL-C水平和HUVECs内DDAH1的mRNA表达,升高HUVECs内ADMA的水平,从而增加不饮酒的中国长沙地区汉族人群冠心病的发病风险。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R544.1;R541.4

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【参考文献】
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