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《中南大学》 2009年
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TIMP-1通过PTEN途径影响衰老相关肾脏微血管生成障碍的机制研究

陈俊香  
【摘要】: 背景和目的:肾脏衰老是机体衰老的重要组成部分。肾脏是高度血管化的器官,随增龄肾脏出现微血管生成障碍,主要表现为局灶性肾小管周及肾小球毛细血管密度减少,肾小球毛细血管床面积减少,管腔闭塞。基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)是一种多功能因子,是基质金属蛋白酶(MMPs)的内源性抑制剂。通过MMPs依赖和非MMPs依赖途径参与多种病理生理过程,其中包括抑制血管生成。我们以往研究发现,随增龄TIMP-1的基因和蛋白水平及酶活性均升高,通过炎症途径促进衰老相关肾脏纤维化,参与肾脏衰老发展进程。但是肾脏器官衰老过程中TIMP-1表达上调是否参与肾脏增龄性血管生成障碍,其机制如何,目前尚不清楚。与张力蛋白同源、第10号染色体丢失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10, PTEN)是一种抑癌基因,其编码蛋白为双重底物特异性磷酸酶,具有脂质磷酸酶和蛋白质磷酸酶活性。近期研究表明,PTEN突变或表达下调,肿瘤血管生成增加;随增龄大鼠和人胃粘膜PTEN表达上调,粘膜血流量下降,组织缺氧。另外,体外研究发现TIMP-1可上调PTEN的蛋白表达,而这与其MMPs抑制活性无关。提示,随增龄,TIMP-1可能通过上调PTEN表达参与组织器官的增龄性血管生成障碍。目前,国内外尚无文献报道TIMP-1通过PTEN途径参与肾脏器官衰老过程。基于以上认识,我们假设,TIMP-1有可能通过上调PTEN表达影响衰老相关肾脏微血管生成障碍。本研究以PTEN为切入点,通过体内外实验观察人TIMP-1转基因小鼠肾脏微血管生成随增龄的变化及与PTEN的关系,研究正、反义人TIMP-1基因转染人近端肾小管上皮细胞(HKC)和人脐静脉内皮细胞(ECV304)PTEN的表达及对血管生成的影响,进一步探讨TIMP-1对肾脏器官衰老的影响机制。 方法:(1)留取3、12、24月龄人TIMP-1转基因小鼠(每组n=8)和野生型小鼠(每组n=8)肾组织。石蜡切片行PAS及VEGF、CD34免疫组化染色;RT-PCR、Western Blot方法检测肾组织内TIMP-1、MMP-9、MMP-2、PTEN、VEGF、Flk-1mRNA及蛋白质表达。(2)将正义和反义人TIMP-1基因转染至人近端肾小管上皮细胞(HKC)和人脐静脉内皮细胞(ECV304)中,同时用与正义转染组细胞酶抑制活性相当的MMP-2/MMP-9抑制剂(MMP-2/MMP-9 InhibitorⅢ, 100μM)干预24小时,RT-PCR、Western Blot方法检测TIMP-1、MMP-2、MMP-9、PTEN、VEGF、Flk-1的mRNA和蛋白质表达;间接免疫荧光法检测各组细胞PTEN、VEGF和Flk-1的表达;明胶酶谱法检测培养上清中明胶酶的活性。(3)将PTEN siRNA转染至稳定表达人正义TIMP-1的人近端肾小管上皮细胞(HKC)和人脐静脉内皮细胞(ECV304)中,RT-PCR、Western Blot方法检测TIMP-1、PTEN、VEGF、Flk-1的mRNA和蛋白质表达。(4)体外三维血管生成实验观察转染人正、反义TIMP-1和MMP-2/MMP-9 InhibitorⅢ(10μM)干预ECV304细胞的血管生成情况。 结果:人TIMP-1转基因小鼠和野生型小鼠随增龄肾组织内出现微血管生成障碍,表现为肾小球毛细血管袢计数减少,肾小管周微血管密度(MCV)下降,稀疏指数增加;然而,在24月龄时,转基因小鼠肾小球毛细血管袢计数低于野生型小鼠(18.57±3.52 vs25.58±4.22;P0.05),管周毛细血管稀疏指数高于野生型小鼠(41.72±8.276 vs 32.96±5.58;P0.05)。另外,与野生型小鼠相比,24月龄时,转基因小鼠肾组织内TIMP-1的表达明显上调(P0.05),明胶酶(MMP-2,9)的表达下调(P0.05),PTEN的表达上调(P0.05), VEGF和Flk-1表达下调(P0.05)。体外研究显示,与未转染和空载体转染组相比,正义TIMP-1转染组中PTEN表达上调(P0.05),明胶酶活性降低(P0.05),VEGF和Flk-1表达下调(P0.05),而反义TIMP-1转染组则相反(P0.05);MMP-2/MMP-9 inhibitorⅢ100μM(酶抑制剂组)组PTEN、VEGF和Flk-1表达与未转染和空载体转染组相比无显著差异,而明胶酶活性与正义TIMP-1转染组无明显差异。PTEN SiRNA转染后,与未转染和对照质粒转染组相比,正义TIMP-1转染组PTEN表达明显下调(P0.05),而VEGF和Flk-1表达上调(P0.05)。体外三维血管生成实验显示,与未转染和空载体转染组相比,反义TIMP-1转染组小管总长度明显增加(4.29±0.35mm,P0.05),酶抑制剂组、正义TIMP-1转染组小管总长度减少(P0.05),酶抑制组小管总长度高于正义TIMP-1转染组(1.71±0.22mm,0.95±0.09mm,P0.05)。 结论:肾脏器官衰老过程中高表达的TIMP-1,通过上调PTEN(非MMP依赖途径),进而下调VEGF、Flk-1表达,肾小球毛细血管袢减少、管腔塌陷,管周微血管密度下降、小管萎缩,最终导致肾小球硬化和小管间质纤维化。提示PTEN在TIMP-1介导肾脏衰老微血管生成障碍中起重要作用,首次证实PTEN表达上调参与肾脏衰老过程。本研究为揭示TIMP-1参与肾脏器官衰老分子机制提供了新的理论依据。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R339.38

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