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《中南大学》 2010年
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NGX6基因对结肠癌血管形成及凋亡影响的研究

连平  
【摘要】: NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室在对鼻咽癌研究中筛选克隆出的一个新基因(Genbank号AF188239)。生物信息学分析显示:NGX6基因cDNA全长2134bp,编码蛋白含338个氨基酸,预测分子量37kDa,含有2个跨膜结构域,胞外区含有1个表皮生长因子(EGF)样结构域和3个糖基化位点,胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。 前期对NGX6基因的研究中发现:NGX6在鼻咽癌活检组织、鼻咽癌上皮细胞株中表达下调甚至缺失,在正常鼻咽组织中存在明确的表达;NGX6基因在结直肠癌中亦存在不同程度的表达下调,且伴有淋巴结转移的结直肠癌样本当中NGX6表达下调的比例(15/16)远高于无淋巴结转移的结直肠癌样本(25/34);利用高通量的组织芯片进行的原位杂交实验发现,NGX6基因的表达在有转移的肿瘤组织下调更明显,且与临床分期相关;将NGX6基因分别转染鼻咽癌和结肠癌细胞之后可以使鼻咽癌细胞和结肠癌细胞的恶性表型得到部分逆转(通过细胞周期、细胞生长曲线、软琼脂集落形成、裸鼠接种等实验获得的数据);并使鼻咽癌和结肠癌细胞的基因/蛋白质表达谱发生某些改变及表皮生长因子受体的磷酸化水平下降;利用绿色荧光蛋白发现NGX6的亚细胞定位主要是细胞膜。 NGX6基因作为具有一个酪氨酸激酶磷酸化位点的膜蛋白,提示了NGX6基因参与细胞内信号传导的一种可能。NGX6基因胞外区含有1个表皮生长因子(EGF)样结构域,EGF样结构域主要和受体一配体间交互作用有关,提示NGX6基因在细胞信号传导中应与有生长因子样结构的膜蛋白有着协同或拮抗作用。同时前期研究证明NGX6基因可以使表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化水平下降,提示NGX6基因可能调控EGFR通路,影响NF-κB的活化,影响肿瘤的发生、发展。 在前期研究工作的基础上,结合对NGX6基因生物信息学特征分析的结果,本研究为进一步对NGX6基因功能的探讨做了如下实验: 1.利用已构建好的pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29结肠癌细胞,通过鸡胚绒毛尿囊膜血管(CAM)形成实验,将结肠癌细胞接种到鸡胚绒毛尿囊膜,发现NGX6基因抑制了鸡胚绒毛尿囊膜血管的形成;将结肠癌细胞接种到裸鼠腋前皮下,发现NGX6基因抑制了结肠癌种植瘤的生长,将种植瘤切片分析证实NGX6基因抑制了结肠癌种植瘤内血管的形成,抑制了种植瘤血管内癌栓的形成,并且抑制了结肠癌的转移;RT-PCR实验表明NGX6基因下调了结肠癌细胞及结肠癌种植瘤内VEGF的表达。这些实验结果表明NGX6基因抑制了结肠癌的血管形成,进而影响了肿瘤的发展及转移。 2.通过PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测发现,对于在体外培养的结肠癌细胞,转染了NGX6基因的与未转染的比较,凋亡并无差别,基本上全都是正常的活细胞;通过EMSA分析结肠癌细胞核蛋白,转染了NGX6基因的结肠癌HT-29细胞NF-κB激活明显受到抑制;将结肠癌细胞接种到裸鼠腋前皮下,将种植瘤通过PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测发现转染了NGX6基因的与未转染的比较,凋亡率明显增高;与化疗药物5-Fu联用后,NGX6基因明显诱导了结肠癌细胞的凋亡。这些实验结果说明NGX6基因通过抑制结肠癌细胞NF-κB的激活,促进了结肠癌细胞的凋亡。 NGX6基因抑制VEGF的表达以及NF-κB的激活间接说明NGX6基因在细胞信号传导中与EGFR信号通路起拮抗作用。本实验说明NGX6基因能抑制肿瘤血管形成以及诱导肿瘤细胞凋亡,此结果为证实NGX6基因是一个抑瘤基因提供一个强有力的证明。结肠癌的侵袭转移是其致命的威胁,本研究中发现NGX6基因抑制了结肠癌的转移,此结果表明NGX6基因对结肠癌患者预后有着积极的影响作用。但是要确定NGX6基因具体的生物学功能以及更为详尽的机制有待以后进一步的研究。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.35

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