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《中南大学》 2009年
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脂联素基因敲除小鼠血管钙化及其钙化机制的研究

赵立玲  
【摘要】: 第一部分脂联素基因敲除小鼠动脉钙化病理特征性观察 目的 观察脂联素基因敲除小鼠组织病理学和组织化学的特性。 方法 SPF级6周龄雄性脂联素基因敲除小鼠纯合子(Adiponectin-/-)30只随机分为5组,第1、2、3组分别给予普通膳食喂养10、20、30周,第4组每2周经颈静脉注射空白腺病毒载体(即β-半乳糖甘酶腺病毒载体)并予普通膳食喂养30周,第5组每2周经颈静脉注射重组脂联素腺病毒载体并予普通膳食喂养30周;另随机选取SPF级6周龄雄性野生型小鼠(WT)6只为正常对照组,编为第6组,给予普通膳食喂养30周。Adiponectin-/-与WT小鼠均由具有C57BL/6J背景的脂联素杂合子(Adiponectin+/-)小鼠相互交配产生。安乐死处死动物,摘眼球取血,分离血浆,采用酶法测定血糖浓度,放射免疫法测定血浆胰岛素和脂联素水平。分离鼠胸主动脉置4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,行茜素红钙化染色,免疫组化方法检测动脉血管壁OPG和RANKL的表达。分离主动脉弓到髂骨分支的动脉,用比色法测定10%甲酸抽提的钙含量。超声破碎胸主动脉,用Bradford法测总蛋白含量,离心后取上清液采用对硝基苯酚法测定ALP活性。 结果 经普通膳食喂养的各组脂联素基因敲除小鼠与野生型小鼠在体重、血糖、血胰岛素水平方面无明显区别。与野生型小鼠、喂养10及20周的脂联素基因敲除小鼠相比,喂养30周的脂联素基因敲除小鼠出现了轻度的动脉钙化,其动脉的钙含量及ALP活性升高,动脉血管壁OPG蛋白表达下降。通过对脂联素基因敲除小鼠进行外源性脂联素的补充,抑制了动脉钙化的出现及ALP活性升高,并增加了血管壁OPG的表达。动脉血管壁未见RANKL蛋白表达。 结论 在普通膳食喂养30周后,脂联素基因敲除小鼠出现轻度的动脉钙化,其机制可能与动脉中升高的ALP活性和OPG蛋白表达下降有关;外源性脂联素的补充可抑制脂联素基因敲除小鼠动脉钙化的发生,提示脂联素为动脉钙化的保护因子。 第二部分脂联素对钙化的血管平滑肌的影响 目的 探讨体外培养的钙化血管平滑肌细胞中脂联素受体和OPG/RANKL/RANK系统的表达及其用重组脂联素干预后对钙化血管平滑肌的影响。 方法 剖杀用普通饮食喂养30W脂联素基因敲除小鼠,分离主动脉行钙化动脉平滑肌细胞培养,应用免疫细胞化学方法鉴定血管平滑肌细胞。应用RT-PCR和Western-blot分别测定AdipoR、OPG、RANKL及RANK mRNA和AdipoR、OPG、RANKL、RANK蛋白在钙化血管平滑肌细胞中的表达情况。取不同浓度的(0,3,10,30μg/mL)脂联素干预钙化的血管平滑肌细胞48h或用30μg/mL脂联素干预12-48h,观察脂联素对血管平滑肌细胞的剂量及时间效应。采用实时定量PCR法检测OPG mRNA水平,ELISA法测定OPG蛋白的表达,对硝基苯酚法测定碱性磷酸酶(ALP)活性,放射免疫法检测骨钙素(OC)含量,Western-blot检测Runx2蛋白的表达。用30μg/mL的脂联素干预20d后,1%茜素红进行钙化结节染色。 结果 钙化血管平滑肌细胞α-肌动蛋白(a-actin)的免疫细胞化学染色证定培养细胞为血管平滑肌细胞,且该细胞能自发形成钙化结节。钙化的平滑肌细胞主要表达脂联素受体R1 mRNA和蛋白,可检测到OPG、RANK mRNA和蛋白,但未能检测到RANKL的mRNA和蛋白。脂联素干预能使钙化的血管平滑肌细胞OPG mRNA和蛋白表达增加,ALP活性降低,OC分泌减少,Runx2蛋白表达下降,并且呈剂量依赖和时间依赖关系。用30μg/mL脂联素干预20d后,钙化血管平滑肌细胞的钙化结节得到显著抑制。 结论 脂联素能抑制培养的钙化血管平滑肌细胞的钙化,其机制可能通过与钙化血管平滑肌细胞上的AdipoRl结合发挥作用,从而促进血管保护因子OPG的表达,并抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞表型的转换。 第三部分脂联素通过AdpoRl/p38信号途径抑制CVSMCs体外成骨样钙化 目的 探讨脂联素抑制脂联素基因敲除鼠钙化血管平滑肌细胞体外成骨样钙化的作用机制。 方法 用30μg/mL脂联素干预钙化血管平滑肌细胞,0、5、30、60min后抽提细胞总蛋白,用Western-blot方法检测细胞传导信号p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK蛋白在细胞内的表达。合成脂联素受体R1的小干扰RNA(AdipoR1-SiRNAs)抑制AdipoRl表达。加入p38信号传导抑制剂SB203580,联合AdipoRl-SiRNAs,用实时定量PCR法检测钙化血管平滑肌细胞OPG mRNA水平的变化,用ELISA法检测OPG蛋白的表达,用对硝基苯酚法测定钙化血管平滑肌细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性。 结果 脂联素可诱导钙化血管平滑肌细胞p38磷酸化,但对JNK和ERK的激活无作用。p38抑制剂SB203580和SiRNAs-AdipoRl可减弱脂联素对钙化血管平滑肌细胞OPG表达的促进作用及ALP活性的影响。说明AdipoRl/p38信号通路在脂联素抑制钙化血管平滑肌细胞的钙化中起重要作用。 结论 脂联素可通过AdipoRl/p38信号途径促进OPG的表达,并抑制钙化血管平滑肌细胞体外成骨样钙化。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R543

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