LMO4/pCREB/pStat3在局灶性脑缺血再灌注大鼠中的表达及依达拉奉的干预研究

【摘要】： 背景及目的：脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率的临床特点,缺血性卒中为其主要类型,严重危害着人类的健康。脑缺血神经元死亡的分子机制特别复杂,目前已发现三条主要的细胞通路与其有关,分别为谷氨酸受体的过度激活、氧化应激及细胞凋亡。LIM蛋白是一类包含有2个或以上LIM结构域的蛋白,LMO4为最近发现的核转录协作因子,属于LIM蛋白家族的一员,通过对转录因子的激活或抑制来调控其他蛋白的功能,在基因表达、细胞分化和发育、细胞骨架的形成中发挥重要作用。pCREB、pStat3也属于核转录因子,部分研究表明二者对脑缺血神经元损伤有保护作用。在脑缺血的细胞模型中,LMO4通过调节IL-6/Stat3细胞信号通路促进体外缺氧神经细胞的存活,而pCREB又可作为上游成分调节LMO4的转录活性。本研究拟在脑缺血再灌注模型中观察LMO4、pCREB、pStat3在缺血半暗带的表达变化及定位,并探讨LMO4与后两者之间的关系及其对脑缺血细胞存活的作用,为缺血性卒中脑保护药物的开发提供新的分子靶点。 方法：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠84只,随机分为假手术组及缺血再灌注1h、3h、6h、12h、24h、48h组,每组12只,6只用于分子生物学检测,余6只用于组织学实验。线栓法制备局灶性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血2小时后恢复再灌住,以Longa5级标准评分法评价神经功能缺损,分别在各再灌注时间点处死动物。常规HE染色观察组织病理学改变；尼氏染色观察神经元的存活；Map2抗体染色观察神经元树突；TUNEL法检测缺血脑组织的凋亡细胞；免疫荧光检测、LMO4、pCREB、pStat3的在缺血半暗带皮层细胞的表达数量及部位；免疫荧光双标观察LMO4与Map2、pCREB、pStat3、TUNEL阳性细胞之间以及pCREB.pStat3与NEUN的共表达情况。RT-PCR法测定假手术组及再灌后不同时间点LMO4mRNA在缺血半暗带的表达水平；western-blot法测定假手术组及再灌后不同时间点LMO4和pStat3、pCREB三分子在缺血半暗带中的蛋白表达水平。 结果：①模型成功率为76.60%,死亡率为13.83%,主要死亡原因为蛛网膜下腔出血、脑水肿；脑组织TTC染色显示成功模型大鼠出现皮层和纹状体梗死,而假手术组大鼠未见梗死。 ②模型组HE染色可见典型的坏死灶、神经元丢失和组织水肿,梗死区细胞总数目呈减少趋势,假手术组细胞形态正常； ③模型组尼氏染色可见细胞肿胀,尼氏体消失,缺血半暗带皮层区存活神经元数目随再灌时间逐渐减少(P0.05),48小时最低(P0.01),假手术组神经元形态正常； ④模型组树突长度变短,直径变小,缺血半暗带皮层区MAP2阳性细胞OD值随再灌时间逐渐减少,48小时最低(P0.01),假手术组神经元树突形态正常； ⑤TUNEL阳性细胞主要分布在梗死周围区,凋亡细胞数再灌后6小时开始增多(P0.05),24小时达高峰,一直持续到48小时(P0.01)； ⑥与假手术组比较,缺血侧半暗带皮层组织LMO4mRNA水平再灌后3小时开始升高,24小时达高峰,48小时明显下降(P0.05或P0.01)； ⑦与假手术组比较,缺血侧半暗带皮层组织LMO4蛋白水平再灌后3小时开始升高,24小时达高峰,48小时明显下降,pCREB、pStat3蛋白水平6小时开始升高,24小时达高峰,48小时逐渐下降(P0.05或P0.01)； ⑧与假手术组比较,LMO4、pCREB、pStat3阳性细胞数再灌后6小时开始升高,24小时达高峰,48小时显著下降(P0.05或P0.01)； ⑨免疫荧光双标显示LMO4和pCREB仅表达于神经元,pStat3在神经元和胶质细胞均可表达；LMO4主要表达于细胞核,少量位于细胞浆,pCREB和pStat3仅表达于细胞核；在缺血半暗带皮层区,LMO4与TUNEL阳性细胞呈分离表达,LMO4与pCREB完全共表达,而与pStat3部分共表达。 结论：①脑缺血再灌后诱导LMO4、pCREB及pStat3表达升高,并呈动态变化趋势,可能为神经细胞对缺血再灌注损伤的一种内部适应性保护机制。 ②LMO4可能通过与pCREB之间的相互作用及调节pStat3性来促进缺血神经元的存活。 背景及目的：依达拉奉是一种合成的新型自由基清除剂和抗氧化剂,可改善脑缺血后引起的神经功能缺损,并且对迟发性神经细胞死亡也有抑制作用。依达拉奉对脑缺血的保护作用较为明确,但其具体的分子机制尤其是抗凋亡的机制并不十分清楚。凋亡为一种基因调控的细胞程序性死亡,而LMO4作为核转录协助因子可调节基因的表达。LMO4基因敲除小鼠出现各种发育障碍,提示其对上皮细胞及神经细胞的抗凋亡作用。本研究拟进一步探讨依达拉奉对脑缺血的保护机制及初步探讨其对LMO4表达的影响。 方法：健康成年雄性SD大鼠36只,随机分为假手术对照组(n=12)、脑缺血模型组(n=12)及依达拉奉治疗组(n=12)。以线栓阻断一侧大脑中动脉构建局灶性脑缺血模型,缺血2小时后恢复再灌住,再灌注24小时后处死动物,药物组在脑缺血再灌注后即刻腹腔注射依达拉奉3mg／kg,模型组注射等量的生理盐水。常规HE染色、尼氏染色观察病理学改变并评价神经元的存活;TUNEL法检测缺血侧脑组织的凋亡细胞；RT-PCR、western-blot、免疫荧光检测三组缺血半暗带皮层LMO4蛋白和mRNA的表达水平,并进行组间比较。结果：①假手术组细胞形态基本正常,模型组和药物组均有细胞坏死,但后者程度减轻,形态正常的细胞数较前者增多(P0.01)；尼氏染色示缺血半暗带皮层存活神经元数目药物组较模型组显著增多(P0.05)： ②假手术组几乎无TUNEL阳性细胞,模型组和药物组梗死周围皮层均可见TUNEL阳性细胞,但后者明显减少(P0.01)； ③假手术组有少量LMO4mRNA和蛋白的表达,模型组皮层半暗带区较多LMO4mRNA和蛋白的表达,与模型组比较,药物组表达水平显著提高(P0.05或P0.01)； ④假手术组可见少量LMO4阳性细胞,模型组缺血半暗带皮层可见大量LMO4阳性细胞,与模型组比较,药物组LMO4阳性细胞数更多(P0.01)。 结论：依达拉奉促进LMO4的表达升高,可能是其脑保护作用机制之一。