FGF8b对上皮—间质表型转化的调控及对前列腺癌侵袭转移影响的研究

【摘要】： 研究背景：前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一,在欧美,尤其在美国前列腺癌的发病率仍超过肺癌,高居第一位；而在我国前列腺癌的发病率呈快速增长趋势。肿瘤的浸润和转移是导致前列腺癌患者死亡的主要原因,前列腺癌细胞如何获得侵袭转移潜能目前尚不十分清楚。因此探讨前列腺癌侵袭转移的分子机制,寻找新的抑制其侵袭转移的治疗靶点有重要的理论意义和临床实用价值。本课题拟先在组织学水平,利用免疫组织化学技术方法检测FGF8b、上皮标志物(E-cadherin)、间质标志物(Vimentin)在前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)手术标本中的表达情况,并探讨FGF8b表达与前列腺癌临床病理学因素的相关性以明确FGF8b表达在前列腺癌侵袭转移过程中的可能作用。然后,选用DU145前列腺癌细胞株作为体外实验的靶细胞,用RT-PCR. Western blotting等方法检测上皮标志物和间质标志物在FGF8b转染前列腺癌细胞株前后的改变以探讨FGF8b能否诱导前列腺癌细胞发生上皮—间质表型转化(EMT),以及对作用后前列腺癌细胞株迁移及侵袭能力的影响,最后探讨FGF8b诱导前列腺癌细胞发生上皮—间质表型转化(EMT)的分子机制。通过本实验研究,将初步揭示前列腺癌中FGF8b表达意义及其促前列腺癌侵袭转移的可能机制,并寻找在该过程中发挥重要作用的关键因子,为干预前列腺癌侵袭转移提供新的有效靶点。 目的：探讨FGF8h、E-cadherin和Vimentin在前列腺癌和BPH中的表达情况,并研究这三种蛋白与前列腺癌临床分期和病理分级的关系,从而为后续研究打下一定基础。 材料和方法：20例BPH标本(55-78岁,平均62.4岁)和49例前列腺癌标本(61-82岁,平均67.3岁)取自中南大学湘雅医院泌尿外科2002-2009年的手术标本及经直肠穿刺活检存档蜡块,标本系10%福尔马林固定,常规石蜡包埋。前列腺癌标本按照Gleason评分。前列腺癌患者术前均未接受内分泌治疗或其他治疗。标本4μm厚连续切片,分别做FGF8b、E-cadherin和Vimentin免疫组化染色,分析其表达水平与前列腺癌临床病理参数的关系。 结果：49例前列腺癌组织标本中,共有33例表达不同程度的FGF8b,阳性表达率为67.35%(33／49)；20例BPH组织标本中,无一例检测到FGF8b表达。在前列腺癌组织和BPH组织中FGF8b的表达差异有统计学意义(P0.01)。在前列腺癌组织中有22例标本E-cadherin表达缺失(22／49,44.90%),27例(27／49,55.10%)阳性表达;Vimentin有29例(29／49,59.18%)表达阳性。统计分析显示,上皮标志物E-cadherin在前列腺癌组织中的表达缺失,以及间质标志物Vimentin的阳性表达均与前列腺癌的临床分期和病理分级显著相关(P0.05)；FGF8b表达与前列腺癌的临床肿瘤分期和病理分级显著相关(P0.05),并且与E-cadherin表达缺失和Vimentin阳性表达相关(P0.05)。 结论：(1)人前列腺癌组织中有FGF8b表达,且其表达与前列腺癌临床分期和病理分级相关；(2)上皮标志物E-cadherin的表达缺失以及间质标志物Vimentin的阳性表达均与前列腺癌的临床分期和病理分级相关； 第二章FGF8b对上皮-间质表型转化的调控及对前列腺癌细胞DU145生物学特性影响的研究 目的：研究FGF8b基因转染对前列腺癌细胞侵袭和转移的影响,探讨其与上皮-间质表型转化的关系。 方法：以前列腺癌细胞株DU145为研究对象,利用脂质体介导转染技术将FGF8b基因转染DU145细胞,经G418筛选得到稳定高表达FGF8b的FGF8b/DU145细胞模型;采用RT-PCR, Western-blot,MTT比色法以及Transwell小室等分子生物学技术和方法,深入研究FGF8b对DU145细胞上皮-间质表型转化相关标志物表达的影响及对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。 结果：成功建立了FGF8b稳定高表达的细胞模型(FGF8b/DU145); FGF8b转染DU145细胞后,细胞变长,细胞-细胞间隙增宽；通过RT-PCR、Western-blot等方法进一步检测了FGF8b转染前列腺癌细胞前后上皮、间质标志物表达的改变,发现转染组细胞中上皮标志物E-cadherin的表达水平与DU145细胞及PcDNA3.1-DU145细胞相比较显著降低,而间质标志物Vimentin在转染组细胞中的表达显著高于对照组；细胞迁移和细胞侵袭试验结果显示,FGF8b转染Du145细胞后,细胞迁移和侵袭能力显著高于对照组. 结论：(1)FGF8b转染DU145细胞后,DU145细胞的侵袭迁移能力增强； (2)FGF8b促进前列腺癌侵袭转移的机制可能是诱导前列腺癌细胞发生上皮-间质表型转化(EMT)。 第三章FGF8b调控前列腺癌细胞上皮间质表型转化的分子机制研究 目的：探讨FGF8b促进前列腺癌DU145细胞上皮间质表型转化的分子机制 方法：Western-blot检测各组细胞ERK1／2通路活性,然后将FGF8b/DU145细胞及DU145细胞在PD98059 (ERK激酶MEK1抑制剂)作用下培养两天,每天光镜下观察细胞形态学的变化,最后Western-blot以及Transwell小室等方法,检测各组细胞EMT相关标志物的变化以及细胞的迁移能力改变。 结果：FGF8b/DU145组ERK1／2活性明显高于对照组,给予PD98059(ERK激酶MEK1抑制剂)后,上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达量与对照组相比明显上调(P0.05)；间质标志物Vimentin表达量明显下调(P0.05)；细胞迁移试验结果提示,在给予PD98059后,FGF8b/DU145组细胞的迁移能力较对照组明显减弱。 结论：FGF8b调控前列腺癌细胞DU145发生上皮-间质表型转化(EMT)可能由ERK激酶通路介导, MEK1作为该信号通路的关键因子之一,可能是干预前列腺侵袭转移的有效靶点。