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《中南大学》 2010年
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超声分子影像显像胰岛移植IBMIR

高峰  
【摘要】: 背景: 胰岛细胞移植是目前有希望根治Ⅰ型糖尿病的治疗方法之一,临床成功移植胰岛的途径是经门静脉移植入肝脏。研究表明接受胰岛移植的患者虽然接受了多个供体胰岛的移植,其胰岛功能低于健康人的20%。移植的胰岛与血液接触后5-15min,胰岛细胞就发生裂解及核浓缩,在移植的初期常伴有大量胰岛的丢失,这些现象被统称为原发性无功能,一个重要的原因是被称为立即经血液介导的炎症反应(Immediately blood mediated inflammatory reaction,以下简称IBMIR)。IBMIR是一种快速、剧烈、非特异性免疫炎症反应,可解释胰岛早期大量丢失和功能损伤,也是临床胰岛移植成功率明显比胰腺移植差的重要原因之一。目前尚无有效、灵敏、实时动态研究IBMIR的方法。这给IBMIR的机制和干预研究带来困难。探索一种实时、有效评价IBMIR发生范围、严重程度的新方法,对于加快IMBIR研究,提高临床胰岛移植效果具有重要的研究价值。 IBMIR是以凝血系统、补体系统激活,中性粒单核细胞浸润为特征的级联反应,导致胰岛被破坏。其发生以血小板活化为放大剂,为我们从凝血系统活化角度识别IBMIR发生程度和范围提供了理论依据。分子影像学的发展,使得影像学从观察大体解剖变化向观察微观分子水平的复杂病理学变化方面转变。超声的灵敏度极高,具有成像简便、快速、实时、可重复等优点,为我们采用超声分子影像技术显示IBMIR发生提供了可能。 目的: 通过制备靶向结合活化血小板的靶向超声造影剂,建立体内外IBMIR模型,采用超声造影及其强度定量分析软件评价靶向超声造影剂显示胰岛移植IBMIR的能力和效果,实现胰岛移植IBMIR的超声分子成像特异性显像。 方法: 一、血栓靶向脂质超声造影剂的制备与鉴定 首先合成荧光标记的能与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合的KGDS—棕榈酸化合物(FITC-KGDS-Palm)。采用“超声匀化+高速机械剪切”法,以FITC-KGDS-Palm为主要原料之一,制备靶向脂质超声造影剂。显微镜观察靶向微泡的形态及分布;马尔文颗粒计数仪检测微泡大小、浓度及分布;荧光显微镜观察KGDS多肽与微泡结合情况;流式细胞仪评价多肽与微泡的结合效率;观察靶向微泡在体内外的稳定性;采用体内外血栓模型,检测靶向微泡与血栓特异性结合的能力。 二、体外IBMIR模型的建立 将500 IEQ和1000 IEQ新生猪胰岛分别与实验组人的7ml新鲜全血混合加入肝素化的管道,使Loops管内新鲜血液中肝素的最终浓度分别为0.001mg/ml、0.01 mg/ml、0.02mg/ml。Loops管固定于钟摆式无级调节温控摇床中摇摆5分钟、10分钟、60分钟,模拟血液在体内血管的流动。空白组健康人新鲜全血抽出后立即作检测,对照组健康人新鲜全血7ml+100μl培养液,摇摆60min。检测血液中BR(血常规)、C3a(人补体片段)、C5b-9(人末端补体复合物)、ATA(凝血酶抗凝血酶复合物)、β-TG(血小板球蛋白)等的变化,称重凝血块的重量并对其行病理学检测。 三、体外IBMIR的超声分子成像 体外IBMIR模型(7ml新鲜全血+1000IEQ新生猪胰岛)超声分子成像实验分为三组,均重复3次:A组为对照组,不加造影剂;B组为普通超声造影剂组;C组为靶向超声造影剂组。将上述各组Loops管道固定于摇床摇杆上,并浸于37℃的水浴槽中。采用超声造影模式实时观察Loops管内的回声,记录超声发现血栓出现的时间,并采用Line成像模式存储在硬盘,脱机分析。实验开始后10min、30min、60min,分别将Loops管内血液经70μm过滤网过滤,其中过滤液行实验室凝血系统(ATA、D-dimer)、补体系统(C3a、C5b-9)及胰岛素含量检测,血栓部分行病理学检测。 四、体内IBMIR的超声分子成像 采用雄性SD大鼠(体重300±g)40只,3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,仰卧位捆绑固定;褪毛剂备皮腹部;腹中线切口约4cm,24G静脉留置针穿刺并固定于肠系膜上静脉,移植物经此途径移植入肝脏门静脉系;采用4.5号头皮针穿刺并固定于阴茎背静脉,采用团注法将0.4ml/kg超声造影剂注入体内。随机分配实验动物,各组均为5只,具体如下:A组为空白对照组,注射靶向超声造影剂,不移植胰岛;B组为普通造影剂对照组,注射普通超声造影剂,移植胰岛;C组为靶向造影剂微囊对照组,注射靶向超声造影剂,移植海藻酸钠微囊;D组为靶向造影剂实验组,注射靶向超声造影剂,移植胰岛,D组按移植胰岛后0、5、15、30、60分钟等再分为五个小组,即D0、D5、D15、D30、D60。 实时动态观察肝脏增强情况;于注射造影剂后5min、15min、30min、60min采集肝脏的左、中、右三个断面的图像,采用Line模式储存于超声仪硬盘,脱机分析。 以上A、B、C各组,均于造影后30min,尾静脉检测血糖水平,采集腹主动脉血液行凝血系统、补体系统、C肽等水平检测。实验完毕,处死动物取肝脏组织10%福尔马林固定,行病理学检测。其中D组的D0、D5、D15、D30、D60小组,分别于造影后0min、5min、15min、60min采集血液及处死动物,取肝脏组织作病理学检测。 结果: 一、血栓靶向超声造影剂的制备与鉴定 KGDS-TUCA靶向超声造影剂呈淡黄色混悬液,微泡浓度约为1.5×109/ml,平均粒径为1.5±0.2μm,98%微泡小于5μm。荧光显微镜显示靶向超声造影剂表面呈明亮的绿色荧光;流式细胞仪检测KGDS结合效率为90.04%;体外4℃保存48h,微泡浓度及粒径无显著性改变;体内团注靶向超声造影剂肝脏平均灰阶值达109.98±18.01,持续时间长约15分钟;体外靶向及其拮抗实验,证实靶向超声造影剂与血栓特异性结合;体内下腔静脉夹闭法建立血栓模型,采用靶向超声造影剂可以增强下腔静脉内血栓。 二、体外IBMIR模型的建立 Tubing Loops内肝素浓度为0.001mg/ml时对新鲜全血的正常生理功能影响最小,可以长时间模拟体内血液生理功能不变。血液样本加入新生猪胰岛以后,1000IEQ实验组于10min开始出现了血凝块,随时间的延长,凝血块逐渐增大。Tubing Loops管中血液的血小板数量随时间延长而减少,β-TG、TAT显著增加;血浆中C3a、C5b-9的增加;淋巴细胞、单核细胞被大量消耗;血凝块病理学检测显示,胰岛细胞周围被血栓包围,其周边及血栓内均可见中性白细胞浸润,胰岛移植物表面包膜被破坏,出现裂解征象。 三、体外IBMIR的超声分子成像 体外Loops管内加入的造影剂的剂量以0.04ml为佳。A组没有加入造影剂,不能发现血栓形成;B组加入自制普通超声造影剂,Loops管内可以显示血栓,血栓周边及内部无增强,呈充盈缺损改变,发现血栓需要时间约为7.3±0.5min,超声平均灰阶值(level)为31.22±3.56;C组加入靶向超声造影剂,Loops管内可以清晰显示环状增强的血栓,发现血栓需要时间约为13.2±0.6min,超声平均灰阶值(level)为75.85±5.21。B组、C组血栓平均灰阶值及发现时间比较均有统计学差异(P0.05)。血液学检测显示实验各组均发生了IBMIR,即凝血系统、补体系统活化,血液胰岛素含量升高。病理检测显示,胰岛与新鲜全血接触后,其表面形成血栓壳,加入带荧光的靶向超声造影剂,荧光显微镜可以清楚观察到胰岛周边呈明亮的荧光光环,与血栓壳位置、形态、范围完全吻合。 四、体内IBMRI的超声分子成像 1.各组肝脏超声增强动态变化:团注超声造影剂后,A组、B组、C组、D组于注射造影剂9秒后肝脏开始增强,A组、B组、C组造影剂约于造影后2分钟开始从肝脏廓清,15分钟后基本廓清,30分钟后完全廓清,肝脏内未见增强声像;D组造影剂也约于造影后2分钟开始从肝脏廓清,但15分钟后肝脏内可见密集星点状增强,持续监测1h没有消退; 2.各组肝脏超声增强定量分析:造影前,各组肝脏平均灰阶值,约为7左右,差异无统计学意义(P0.05);造影10min后,D组平均灰阶值为52.22±6.73,明显高于A组、B组、C组的平均灰阶值(P0.05);造影30分钟后,A组、B组、C组、D组平均灰阶值均降低, A组、B组、C组与造影前相比差异无统计学意义(P0.05),而D组平均灰阶值明显高于造影前强度(P0.05)。 3.血液学检测结果:A组、C组没有移植微囊,其血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9、血糖等均没有变化(P0.05);B组、D组移植胰岛30 min后,血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9明显升高,血糖下降,差异有统计学意义(P0.05);D组内各小组血液学指标显示ATA于15min, C3a、C5b-9含量于5min时达最高水平,分别为82±10.5μg/ml、45±4.6ng/ml、116±9.5 ng/ml,之后随时间延长而逐渐降低,30min时分别为41.2±4.7μg/ml、11.7±5.3 ng/ml、29.6±8.3 ng/ml,差异有统计学意义(P0.05),而D-dimer则随时间延长而逐渐升高(P0.05)。 结论: 1.本研究采用“超声匀化+高速机械剪切法”,首先合成KGDS-Palm化合物,以之为主要原料,制备出靶向超声造影剂,其合成方法简单,制备过程中不需添加造影剂原料以外的材料,利于靶向造影剂的制备及纯化;配体KGDS结合率高,达90.04%;KGDS-TUCA靶向超声造影剂体内外稳定性好、靶向结合特异性强。 2.胰岛与新鲜全血接触后,激活凝血系统、补体系统,血小板、中性粒细胞、单核细胞大量消耗,胰岛形态完整性被破坏,发生IBMIR反应。采用1000IEQ新生猪胰岛加至肝素终浓度为0.001mg/ml的含7ml健康人新鲜全血的体外循环管道,固定于钟摆式摇床中可以建立稳定、标准化的IBMIR体外模型。 3.体外胰岛移植IBMIR模型,KGDS-TUCA靶向超声造影剂可以靶向结合于胰岛表面血栓壳,能有效显示IBMIR的发生及其范围、程度。 4.肝内移植胰岛,激活凝血系统、补体系统;机体为维持内环境的稳定性,相应的纤溶系统、补体调节系统被激活,凝血系统、补体系统活化受到对抗。注入KGDS-TUCA靶向超声造影剂,可以特异性结合并浓集在胰岛周围,随着游离靶向微泡的廓清,实现靶位与背景的高信噪比,显像肝内胰岛移植IBMIR发生范围和程度,有望成为评价胰岛移植IBMIR的无创、有效、动态、实时、简便的检测方法。
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