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《中南大学》 2010年
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内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖与表型转化的抑制作用及其机制研究

方立  
【摘要】: 第一章内皮祖细胞与血管平滑肌细胞共培养条件下内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响 研究背景:近年来大量研究提示内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPCs)能够延缓高血压、冠心病、血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病血管重塑的进程。鉴于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的增殖是形成高血压、冠心病、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的共同细胞病理基础之一,本实验拟从细胞水平探讨共培养体系下EPCs对大鼠VSMCs增殖的影响。 方法:采用3%明胶沉降红细胞及密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,利用内皮生长培养基(Endothelial growth medium-2,EGM-2,含EPCs分化所需各种生长因子)进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双染色鉴定正在分化的EPCs;流式细胞仪和间接免疫荧光法检测EPCs干细胞分子标志CD34/CD133以及内皮细胞分子标志FLK-1/VWF/CD31/ VE-cadherin/CD 105/CD 146;采用Transwell培养板建立早期EPCs和VSMCs共培养模式,20%FBS诱导VSMCs增殖,利用BrdU标记和蛋白定量法检测血管平滑肌细胞DNA和蛋白合成能力,观察共培养条件下EPCs对VSMCs增殖的影响。 结果:从人脐血单个核细胞成功分离培养EPCs,早期EPCs和VSMCs共培养12,24,48和72h时,血管平滑肌细胞DNA和蛋白合成能力均较对照组明显降低(P0.05);与此类似,流式细胞术结果显示共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P0.05),其中均以48h抑制效果最明显。 结论:共培养条件下早期EPCs能够抑制血管平滑肌细胞DNA和总蛋白的合成,其机制可能与早期EPCs通过阻滞细胞周期进程抑制VSMCs的增殖有关。 第二章内皮祖细胞对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖与表型转化的抑制作用 研究背景:VSMCs表型转化是高血压、冠心病和血管成形术后再狭窄等心血管疾病VSMCs增殖和迁移的关键性起始步骤。病理条件下VSMCs的增殖和表型转化受到多种血管活性物质和细胞因子的调控,其中AngⅡ诱导的VSMCs增殖和表型转化在心血管疾病的发生、发展中起着非常重要的作用。为了进一步阐明EPCs对VSMCs病理性增殖和表型转化的抑制作用及其机制,本研究拟采用AngⅡ刺激VSMCs后,观察内皮祖细胞条件培养基对VSMCs增殖、表型转化及其信号转导通路的影响。 方法:分别制备早期EPCs条件培养基(E-EPC-CM)、晚期EPCs条件培养基(L-EPC-CM)以及人脐静脉内皮细胞条件培养基(HUVEC-CM)后,采用BrdU标记法、蛋白定量、MTT以及流式细胞术分析E-EPC-CM、L-EPC-CM、HUVEC-CM对AngⅡ诱导的VSMCsDNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率、细胞周期进程以及VSMCs收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白(α-smootn musle actin,α-SM-actin)和合成表型标志基因骨桥蛋白(osteopontin, OPN)表达变化的影响;进一步采用RT-PCR和Western-blot观察E-EPC-CM、L-EPC-CM、HUVEC-CM对AngⅡ诱导的VSMCs MAPK (P38、JNK、ERK活化)和NF-κB(P65活化)信号通路以及原癌基因c-myc、c-fos表达的影响。 结果:AngⅡ(10-6mmol/L)诱导VSMCs增殖48h后,血管平滑肌细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组明显增加(P0.05);细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著增加,G1期细胞所占百分率均相应较对照组减少(P0.05);α-SM-actin mRNA和蛋白表达明显减少,而OPN mRNA和蛋白表达明显增加(P0.05),提示VSMCs从收缩表型向合成表型转化;P38、JNK. ERK、P65活化以及原癌基因c-myc、c-fos的表达均较对照组显著增加(P0.05)。E-EPC-CM、L-EPC-CM、HUVEC-CM预处理后能够显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率的增加以及阻滞VSMCs从Gl期向S期的转化;并且抑制VSMCs从收缩表型向合成表型转化,其中均以E-EPC-CM的抑制效果最明显(P0.05)。同样E-EPC-CM也抑制了AngⅡ诱导的P38、JNK、ERK.P65的活化以及c-myc、c-fos的表达(P0.05)。 结论:EPCs能够抑制AngⅡ诱导的VSMCs病理性增殖和表型转化,其机制可能与其抑制MAPK和NF-κB信号通路的活化以及原癌基因c-myc、c-fos的表达有关。 第三章降钙素基因相关肽介导内皮祖细胞抑制血管平滑肌细胞的增殖与表型转化 研究背景:EPCs许多生物学功能主要都是通过其旁分泌功能而实现的,研究表明降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)能够显著抑制AngⅡ等诱导的VSMCs增殖和表型转化,已有研究证实EPCs(主要是早期EPCs)能够合成并分泌CGRP。前一章研究已证实EPCs可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖与表型转化,那么EPCs通过旁分泌释放的CGRP是否参与这一过程值得进一步探讨。因此,本研究拟初步探讨CGRP在EPCs抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖与表型转化过程中的作用和可能的分子机制。 方法:采用ELISA和RT-PCR检测EPCs和脐静脉内皮细胞CGRP的表达情况,对E-EPC-CM采取CGRP抗体封闭和CGRP受体阻断策略后,观察E-EPC-CM对AngⅡ诱导的VSMCs的增殖、表型转化及其MAPK、NF-κB信号转导通路和原癌基因c-myc、c-fos表达的影响。 结果:早期EPCs能够表达并分泌高浓度的CGRP,并且显著高于晚期EPCs和HUVEC; CGRP阻断后,E-EPC-CM对AngⅡ诱导的VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率、细胞周期进程以及表型转化的的抑制作用均较对照组明显降低(P0.05);并且对MAPK(P38. JNK、ERK)、NF-κB(P65)信号转导通路的活化以及原癌基因c-myc、c-fos表达的抑制能力也较对照组明显降低(P0.05)。 结论:EPCs通过旁分泌CGRP抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖与表型转化。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R543

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【参考文献】
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