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《中南大学》 2010年
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RASSF1A基因通过调控细胞凋亡、细胞周期和AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤A375细胞的机制研究

易梅  
【摘要】: [RASSF1A基因在黑色素瘤细胞和组织中表达下调] RASSFIA是定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21.3位点的抑瘤基因,编码一个微管相关蛋白。该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默,是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。前期多项研究指出,除了在上皮性肿瘤中发生甲基化之外,RASSF1A基因在恶性黑色素瘤细胞中也存在高频甲基化,提示该基因在黑色素瘤的发生过程中也可能存在表达异常。在本研究中,我们首次采用免疫组织化学及western blot的方法研究了RASSFIA基因在正常皮肤组织、皮肤色素痣以及恶性黑色素瘤组织和细胞系中的表达,结果发现,RASSF1A蛋白在正常皮肤色素细胞和色素痣细胞中高表达,而在恶性黑色素瘤组织中表达下调甚至缺失,并与肿瘤的转移呈负相关。RASSFIA蛋白在非转移性黑色素瘤细胞系中有微弱表达,而在转移性黑色素瘤细胞系中表达缺失。该结果证实了RASSFIA在黑色素瘤组织和细胞中表达下调,强烈提示RASSFIA参与了黑色素瘤的发生与演进过程。 [RASSFIA基因具有抑制黑色素瘤细胞生长、增殖的作用] 以往关于RASSFIA基因功能的研究绝大部分都是在上皮性肿瘤中开展的,为了进一步探讨RASSF1A基因是否参与了恶黑的发生发展,我们在RASSF1A基因表达缺失的恶黑细胞系中转染RASSF1A基因,恢复其表达,建立稳定转染的细胞系,研究该基因对恶黑细胞生物学行为的影响。细胞生长曲线测定结果表明,稳定转染RASSF1A基因抑制了A375细胞的生长与增殖能力;平板集落形成实验表明该基因同时抑制了A375细胞的克隆集落形成能力;进一步采用裸鼠移植瘤的方法证实,稳定表达RASSF1A基因不仅抑制了A375细胞的体外增殖能力,而且抑制了该细胞在裸鼠体内形成移植瘤的能力。以上结果表明:RASSF1A基因具有抑制恶黑细胞生长增殖的能力,是一个黑色素瘤抑瘤基因。 [RASSF1A基因通过促进细胞凋亡,引起细胞周期G1-S期阻滞抑制黑色素瘤细胞的生长与增殖] 肿瘤细胞的生长与增殖受抑制,通常是通过影响细胞周期进程或者凋亡过程而实现。为了研究RASSF1A抑制恶黑的机制,我们对细胞周期及细胞凋亡进行了分析。Hochest 33258染色发现稳定表达RASSF1A基因的A375细胞存在细胞核固缩、浓染,是典型的细胞凋亡的形态;通过流式细胞仪检测进一步证明,稳定表达RASSF1A的A375细胞凋亡率增加;细胞周期进程分析结果表明,稳定表达RASSF1A基因的A375细胞停留于G1期的细胞比例增加,而S期细胞比例降低,两者相比具有统计学差异,说明RASSF1A稳定表达引起A375细胞周期G1-S期阻滞。Western blot检测发现RASSF1A抑制了cyclin D1和磷酸化Rb蛋白的表达;RASSF1A抑制cyclin D1蛋白表达是通过降低其蛋白稳定性。以上结果说明,RASSF1A是通过同时影响细胞凋亡与细胞周期而抑制恶黑细胞的增殖能力与致瘤性。 [RASSF1A基因对黑色素瘤细胞A375基因表达谱的影响] 为了研究RASSF1A基因稳定表达对A375细胞基因表达谱的影响,采用Affimatrix公司全基因组表达谱芯片筛查受RASSF1A表达所调控的差异表达基因。筛选出受RASSF1A基因调控黑色素瘤A375细胞中差异表达的基因共210个,其中上调184个,下调26个基因。为了验证基因芯片的数据的可靠性,采用realtime RT-PCR方法检测部分差异表达的基因,结果表明realtime RT-PCR检测结果与芯片检测结果一致,说明芯片数据可靠。通过生物信息学分析差异表达基因的功能归类,发现RASSF1A调控的差异基因功能涉及转录与信号通路调控、细胞生长与增殖调控、细胞周期、细胞凋亡、细胞间粘附、细胞免疫应答等过程,提示RASSF1A可能通过影响这些基因的表达从而影响A375细胞相应的生物学过程。 [RASSF1A基因通过上调ASK1表达活化P38 MAPK,激活线粒体凋亡途径] 基因芯片筛查发现RASSF1A基因稳定表达引起细胞凋亡相关分子ASK1表达上调,结合前期发现RASSF1A稳定表达促进A375细胞凋亡,我们认为RASSF1A可能是通过影响ASK1的表达从而促进恶黑细胞凋亡。通过realtime RT-PCR和western blot检测证实RASSF1A转染后ASK1的表达水平上调。由于ASK1是JNK、P38 MAPK的上游激酶,我们采用western blot分析了JNK、P38 MAPK的表达,结果表明磷酸化P38 MAPK表达增加,total P38 MAPK表达水平没有改变;在RASSF1A转染细胞和空载体对照细胞中,我们没有检测到磷酸化的JNK表达。说明RASSF1A引起ASK1表达上调促进了P38 MAPK的活化;western blot分析发现RASSF1A下调Bcl2表达,并引起cytochromec从线粒体漏出至胞浆,促进了caspase 3的表达与活化,说明RASSF1A通过活化P38 MAPK激活线粒体凋亡途径,是其促进细胞凋亡的分子机制。在RASSF1A稳定表达的细胞中采用RNAi的方法抑制ASK1表达,结果细胞凋亡率下降,说明RASSF1A促进恶黑细胞凋亡的作用部分依赖于ASK1。 [RASSF1A负调控AKT/mTOR信号通路] RASSF1A抑制恶黑细胞增殖、促进凋亡的作用有可能是通过影响细胞信号传导。采用western blot分析与增殖、凋亡密切相关的细胞信号通路的表达与活化,结果发现RASSF1A抑制了AKT的磷酸化,并引起其下游mTOR通路的p70S6K与eIF4E磷酸化水平降低,对其总蛋白表达没有影响,表明RASSF1A抑制了A375细胞AKT/mTOR通路的活化。在RASSF1A稳定表达的细胞中瞬时转染myc-AKT1质粒,结果发现过表达AKT1可以逆转RASSF1A对凋亡、细胞周期相关分子的调节,具体表现为:瞬时转染分子myc-AKT1引起RASSF1A/A375细胞中磷酸化P38 MAPK表达下调,而磷酸化eIF4E、Bcl2和cycling D1表达水平上调,说明过表达AKT1可以逆转RASSF1A对这些分子的调控作用,也就是说,RASSF1A抑制eIF4E磷酸化、Bcl2和cycling D1表达的作用是通过抑制AKT的活性而实现,因此RASSFIA抑制AKT/mTOR信号通路是其调控细胞凋亡、细胞周期进程的上游分子事件。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R739.5

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 乌新春;段晰所;;恶性黑色素瘤的研究进展[J];承德医学院学报;2008年03期
2 祝伟星,王启俊,李玲,邢秀梅;北京城区1993-1997年恶性肿瘤发病率分析[J];肿瘤防治杂志;2003年08期
3 黄庆,郭颖,府伟灵;人类表观基因组计划[J];生命的化学;2004年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 赵连梅;韩丽娜;单保恩;潘晓明;刘丽华;李晓光;;木鳖子提取物体外抗肿瘤活性的初步研究[J];癌变.畸变.突变;2010年01期
2 黄秀兰;崔国辉;周克元;;PI3K-Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展[J];癌症;2008年03期
3 曹传武;李莉;钱建新;武清;骆益宙;许青;王杰军;;肺癌患者贫血相关因素分析[J];蚌埠医学院学报;2007年01期
4 乌新春;段晰所;;恶性黑色素瘤的研究进展[J];承德医学院学报;2008年03期
5 郭颖,黄庆,府伟灵;发夹式siRNA对hDNMT1基因表达的抑制作用[J];重庆医学;2004年08期
6 五且昆·吐尔逊;陈艳;李惠武;;nm23-H1基因CpG岛甲基化与食管癌的关系[J];地方病通报;2009年02期
7 党姗姗;朱叶芳;王少雯;华子瑜;;ERK1/2对胆红素诱导的海马神经元损伤及NF-κB表达的影响[J];第三军医大学学报;2011年14期
8 孙嫣;田华;肖法嫚;谢晓云;宋于刚;;PI3K p85α在大肠癌癌变过程中的表达及意义[J];南方医科大学学报;2009年03期
9 李鑫;胡兰;季安全;郗永义;;DNA甲基化与个体年龄的相关性研究进展[J];法律与医学杂志;2006年04期
10 王玉容;方向明;徐勇;叶文春;高莉;;蛋白酶体抑制剂MG132对早期糖尿病肾病大鼠肾脏MKP-1表达的影响[J];广东医学;2012年04期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 覃小敏;李琳;成莉;毛小刚;刘永红;庄苏陵;邢辉;;PI3K/Akt2对P38MAPK信号通路的抑制与卵巢癌耐药[A];中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第十一届全国学术会议论文汇编[C];2011年
2 邢宝松;郭启祥;马强;阎祥洲;白红杰;;DNA甲基化检测方法研究进展[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 纪铁凤;整合素α_vβ_3介导的~(99m)Tc-3PRGD_2在乳腺肿瘤中的实验研究[D];吉林大学;2011年
2 张继红;Ang/Tie-2在结直肠癌中的表达及其分子机制的研究[D];吉林大学;2011年
3 王大广;胃癌信号传导蛋白表达谱筛选和分析及XIAP、CDK6抑制剂对胃癌细胞的影响[D];吉林大学;2011年
4 刘元;20(S)-原人参二醇对不同类型细胞与脂筏相关的Akt信号通路的调节机制[D];北京中医药大学;2011年
5 李汛;甲胎蛋白影响乙肝相关性肝癌发生的分子作用机制[D];兰州大学;2010年
6 柳珑;GEFT调节晶状体上皮细胞分化的机制研究[D];湖南师范大学;2011年
7 夏茵茵;21三体综合征21qCpG岛DNA甲基化水平研究[D];重庆医科大学;2011年
8 周为军;细胞间黏附分子5在缺血缺氧环境中对PAJU细胞的保护作用及其机制的研究[D];中南大学;2011年
9 柳永蕾;PI3K-Akt信号通路对钙蛋白酶6表达及生物学功能的调控及其分子机制[D];复旦大学;2011年
10 卢佩琳;新型小分子Rab7b在高三尖杉酯碱诱导K562细胞死亡及在自噬中的作用研究[D];浙江大学;2011年
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1 陈进步;血浆DNA定量检测在鉴别诊断各种肝病中的临床应用价值[D];南京医科大学;2009年
2 曹戌;HIV-1 Nef蛋白抑制前列腺癌细胞生长及其分子机制初探[D];南京医科大学;2009年
3 杨郁;PI3K/Akt-PAK1信号通路在表皮生长因子诱导乳腺癌细胞迁移中作用机制的研究[D];南京医科大学;2010年
4 张晋;视蛋白基因3(opsin3)参与调节肝癌细胞5-Fu耐药性的机制研究[D];南京医科大学;2010年
5 倪静;CCND1G870A基因多态性与宫颈癌、卵巢癌易感性的分子流行病学研究[D];南京医科大学;2010年
6 黄骁昊;雷藤甲素对离体子内膜癌细胞株增殖及凋亡信号通路PI3K/PKB的影响[D];南京医科大学;2010年
7 宋宁宁;ILK,PI3K及PTEN蛋白在病理性瘢痕中的表达及意义[D];郑州大学;2010年
8 袁小庚;急性白血病细胞EDNRB基因启动子区甲基化状态研究[D];郑州大学;2010年
9 张永晶;肝星形细胞的生长因子信号通路相关基因与大鼠肝再生的相关性研究[D];河南师范大学;2010年
10 海燕;非小细胞肺癌细胞中Nrf2的调控与生物学功能研究[D];浙江大学;2011年
【二级参考文献】
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1 熊芬,李慎秋;皮肤恶性黑素瘤的易感基因[J];国外医学.皮肤性病学分册;2004年05期
2 张开金,李学信;肿瘤描述流行病学[J];肿瘤防治杂志;2001年04期
3 祝伟星,王启俊,李玲,邢秀梅;北京城区1993-1997年恶性肿瘤发病率分析[J];肿瘤防治杂志;2003年08期
4 郭琳洁,吴中耀,张胜,陈家祺,艾思明,郑湖玲;葡萄膜黑色素瘤病理学特征与预后的关系[J];中华病理学杂志;2002年06期
5 张忠清,李广灿,叶召;乳腺癌当前流行趋势分析[J];中国肿瘤;2000年10期
6 董志伟,乔友林,李连弟,陈育德,王润田,雷通海,饶克勤,王汝宽,赵平,游伟程,鲁凤珠,戴旭东,王国清,罗贤懋,周海城;中国癌症控制策略研究报告[J];中国肿瘤;2002年05期
7 李连弟,饶克勤,张思维,鲁凤珠,邹小农;中国12市县1993年~1997年肿瘤发病和死亡登记资料统计分析[J];中国肿瘤;2002年09期
【相似文献】
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1 邵康,肖智雄,唐槐静,程邦昌,张德超,周芳,熊美华,姆巴东,黄微,张翠艳,赫捷;RASSF1 A转录本在肺癌组织中表达及其临床意义[J];中华医学杂志;2003年07期
2 张森,赫捷;新型肺癌候选抑癌基因RASSF1A研究进展[J];国外医学.肿瘤学分册;2004年04期
3 薛万江,钱海鑫,管洪庚,周晓俊,秦磊,余水长;野生型和突变型RASSF1A基因对人肝癌细胞生长的影响[J];中华实验外科杂志;2004年12期
4 王翔,高文信;RASSF1A甲基化与头颈部肿瘤的研究进展[J];口腔医学研究;2005年02期
5 张家浩,姜昊文,顾静文,张元芳;RASSF1A基因在前列腺癌中甲基化检测及其表达[J];上海医学;2005年05期
6 康宗跃;RASSF1A:一个新的抑癌基因及其在泌尿系肿瘤中的研究进展[J];国外医学.泌尿系统分册;2004年01期
7 高云霞,关明,苏兵,刘维薇,陈宇明,张万忠,吕元;SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测脑胶质瘤中RASSF1A mRNA[J];复旦学报(医学版);2004年06期
8 盛伟利,梅同华;RAS区域相关家族基因与肺癌[J];医学综述;2005年03期
9 陈勇军,唐启彬,邹声泉;散发性肝外胆管癌中RASSF1A基因启动子甲基化状态的研究[J];中华实验外科杂志;2004年12期
10 彭宏,赵彤,姚开泰;鼻咽癌组织RASSF1A基因的表达[J];第一军医大学学报;2003年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 吴缅;;MicroRNA调控黑色素瘤发生机制(英文)[A];第三届细胞结构与功能的信号基础研讨会论文摘要[C];2010年
2 黎川;;黑色素瘤的MRI诊断[A];2010中华医学会影像技术分会第十八次全国学术大会论文集[C];2010年
3 许宇;赵培泉;朱颖;;视盘上的黑色素细胞瘤抑或是黑色素瘤[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年
4 王国华;;恶性黑色素瘤胃转移的X线表现(附5例分析)[A];全国非血管性与血管性介入新技术学术研讨大会(第二届介入放射学新技术提高班、第二届河南省肿瘤介入诊疗学术大会)论文汇编[C];2004年
5 贾兰青;罗利群;张友会;;转导B_7-1基因消除IFN-γ对黑色素瘤转移潜力的增强作用[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
6 胡巍;张超;方芸;;雾化吸入羟基喜树碱对小鼠黑色素瘤肺转移的药效学及体外作用机制研究[A];2010年江苏省药学大会暨第十届江苏省药师周大会论文集[C];2010年
7 王寅;林文;殷明;姜遠英;陈新生;;5—脂氧合酶对黑色素瘤A375粘附及整合素表达的作用[A];海峡两岸三地药理学学术报告会论文汇编[C];2001年
8 徐辉;唐桂波;;黑色素瘤脑转移的MRI表现[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编(上册)[C];2006年
9 胡巍;张超;方芸;;雾化吸入羟基喜树碱对小鼠黑色素瘤肺转移的药效学及体外作用机制研究[A];2010施慧达杯第十届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2010年
10 安菊生;吴令英;李宁;俞高志;刘丽影;;原发女性生殖道黑色素瘤42例临床分析[A];中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 健康时报特约记者 管九苹;澳大利亚免费普查黑色素瘤[N];健康时报;2010年
2 实习生 易立;黑色素瘤,是否无药可治?[N];科技日报;2011年
3 本报记者 聂国春;专家:黑色素瘤可防可治[N];中国消费者报;2011年
4 本报记者 慕欣;解读2011版中国黑色素瘤诊治指南[N];医药经济报;2011年
5 老曲;美科学家发现化疗对黑色素瘤无效的原因[N];北京科技报;2002年
6 王伦 刘晨;探索黑色素瘤治疗新技术[N];保健时报;2009年
7 记者 张旸;美国首次批准治疗黑色素瘤药物[N];人民日报;2011年
8 记者 王小龙;新药可提高晚期黑色素瘤患者存活率[N];科技日报;2011年
9 北京肿瘤医院肾癌黑色素瘤内科主任 郭军;自检法则识别黑色素瘤[N];保健时报;2009年
10 伊遥;易普利姆玛:黑色素瘤治疗的新标杆[N];中国医药报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 易梅;RASSF1A基因通过调控细胞凋亡、细胞周期和AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤A375细胞的机制研究[D];中南大学;2010年
2 李熳;黑色素瘤转移相关蛋白的差异蛋白质组学研究[D];天津医科大学;2010年
3 王爽;人体皮肤黑色素近红外荧光及拉曼光谱特性研究[D];西北大学;2011年
4 白津;JWA通过整合素信号通路调节黑色素瘤转移的分子机制研究[D];南京医科大学;2010年
5 金雷;MiRNA-149~*调控黑色素瘤应对内质网压力的研究[D];中国科学技术大学;2010年
6 龙海;黑色素瘤全基因组DNA甲基化与组蛋白甲基化异常谱式的研究[D];中南大学;2011年
7 Ali Abdul Wahid Abdul Hussein Al Shawi;通过高通量筛选技术从中药材中发现抗黑色素瘤的新天然化合物[D];东北师范大学;2011年
8 周斌;Rap1GAP抑制黑色素瘤VEGF自分泌和旁分泌机制研究[D];华中科技大学;2011年
9 魏文斌;葡萄膜黑色素瘤局部切除预后影响因素及血清肿瘤标记物探讨[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
10 杨明;CpG ODN-MF59辅佐肿瘤抗原诱导抗小鼠黑色素瘤及肺癌的实验研究[D];吉林大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 关向宏;黑色素瘤抗原基因在胃癌组织中表达的研究[D];青岛大学;2002年
2 赵强;口腔粘膜黑色素瘤的临床病理学及与P16-CyclinDl-pRb通路的关系研究[D];郑州大学;2003年
3 冯蕾;抗人黑色素瘤嵌合抗体的构建及表达[D];第四军医大学;2005年
4 吴静静;黑色素瘤病人淋巴细胞表面TRAIL表达的意义[D];安徽医科大学;2005年
5 刘艳荣;局部微环境在小鼠黑色素瘤线形程序性坏死形成中的作用及分子机制研究[D];天津医科大学;2010年
6 杨铮;眼黑色素瘤病人眼球摘除术后死亡原因的临床及病理分析[D];吉林大学;2006年
7 刘洁;小鼠黑色素瘤抗独特型抗体的制备及生物活性研究[D];中国协和医科大学;2006年
8 苑超;肢体恶性黑色素瘤的临床治疗疗效对比研究[D];浙江大学;2008年
9 尹利华;Bmi-1在黑色素瘤中的表达及其与ki-67、P16相关性分析[D];大连医科大学;2009年
10 彭细毛;口服重组沙门菌SL7207/mtHSP70/HSV-TK靶向抗小鼠黑色素瘤实验研究[D];南方医科大学;2010年
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