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《中南大学》 2010年
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HSP70调控雷帕霉素对鼻咽癌细胞生长抑制作用分子机制研究

谢李  
【摘要】: 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤之一,发病率为10-50/10万人口,死亡率在全身恶性肿瘤中的比例,全国第八,两广居第三位。目前该病的治疗仍然以放射治疗为主。对放疗不敏感、放疗后复发以及中晚期的患者,可采取化学药物治疗。但传统的放、化疗存在特异性抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大等缺点。 分子靶向治疗作为肿瘤学研究的一个新兴的热点对于改善临床鼻咽癌的疗效具有重要意义。它针对可能导致细胞癌变的环节,如细胞信号传导通路、原癌基因和抑癌基因、细胞因子及受体、抗肿瘤血管形成、自杀基因等,从分子水平来逆转这种恶性生物学行为,从而抑制肿瘤细胞生长,甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式。雷帕霉素作为一种新型的分子靶向治疗药物,在诸多实体瘤中取得了不同程度的疗效,其中部分研究已经进入了Ⅲ期临床试验,成果令人鼓舞,同时让我们对雷帕霉素治疗鼻咽癌的效果充满了期待。如果雷帕霉素能够成功用于鼻咽癌的分子靶向治疗,不仅能造福患者,提高生存率,还能产生相当的经济效益和社会效益。 本研究以雷帕霉素为切入点,探讨该药物对不同生物学特性的鼻咽癌细胞所产生的生长抑制作用及其蛋白质分子机制。并以此为基础,进一步揭示沉默鼻咽癌中HSP70表达对雷帕霉素抑制作用的影响以及相关依据初探。整个研究内容分三部分进行: 方法 通过MTS法确定mTOR抑制剂雷帕霉素作用三株鼻咽癌细胞产生最佳生长抑制率所需浓度和作用时间。 结果 1.雷帕霉素对不同生物学特性的鼻咽癌细胞均有抑制其生长的作用,该作用的发挥可能是通过靶向抑制mTOR激酶活性来实现的; 2.抑制率呈现剂量和时间依赖性,不同细胞株之间无显著差别,基本稳定在40%-50%之间,最高为53.9%; 3.对于三个细胞株而言,100nM雷帕霉素作用48小时均能让药物所致生长抑制率进入平台期。 方法 1.采用Western Blotting法检测不同浓度雷帕霉素作用下三株细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键性蛋白标记物(p-Akt Ser473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表达情况; 2.采用Western Blotting法检测100nM雷帕霉素作用不同时间后三株细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键性蛋白标记物(p-Akt Ser473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表达情况。 结果 1.CNE-1和6-10B细胞p-mTOR Ser2448表达情况表现出一定的浓度、时间依赖性,而5-8F细胞中该指标不随药物浓度和作用时间改变而变化; 2.6-10B和5-8F细胞p-Akt Ser473随药物浓度增加而表达增高,而CNE-1则呈“上升-下降”趋势; 3.三个细胞株p-Akt Ser473当100nM雷帕霉素作用不同时间后,在1hr时表达明显增高,随着药物作用时间继续延长,表达较lhr相比有下降,但是除6-10B外,均比0hr高; 4. mTOR、Akt、HSP70的表达保持相对稳定,未呈现明显时间、剂量依赖性改变。 方法 1.分别采用RT-PCR法和Western Blotting法初步验证HSP70siRNA在鼻咽癌细胞株中使目标基因/蛋白产生满意沉默效果所需作用时间; 2.采用MTS法进行Control siRNA组、HSP70 siRNA组、Control siRNA+100nM Rapa组和HSP70 siRNA+100nM Rapa组组间生长抑制率比较; 3.采用光学显微镜明视野观察不同干预措施下的四组细胞形态学变化; 4.采用Western Blotting法检测Control siRNA组、HSP70 siRNA组、Control siRNA+100nM Rapa组和HSP70 siRNA+100nM Rapa组细胞中PI3K/ Akt/mTOR信号通路中关键性蛋白标记物(p-Akt Ser473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表达情况。 结果 1.RT-PCR法显示siRNA作用48hrs,在基因水平可达到HSP70相对较高抑制率,而Western Blotting法显示siRNA作用72hrs,可在蛋白质水平达到HSP70相对较高抑制率; 2.三个细胞株中四个不同干预组互相比较,HSP70 siRNA+ 100nM Rapa组生长抑制率最高; 3.与Control siRNA组比较,Control siRNA+100nM Rapa组与第二部分的Rapa作用48hrs的情况相类似,能够提升细胞中p-AktSer473表达,而HSP70 siRNA+100nM Rapa组中,p-Akt Ser473表达下降; 4.与单用siRNA组别比较,Control siRNA+100nM Rapa和HSP70 siRNA+100nM Rapa组中,CNE-1和6-10B细胞p-mTORSer2448表达下调,而5-8F无明显变化; 5.mTOR、Akt的表达组间比较无明显变化。 结论 本文采用MTS法、Western Blotting法、脂质体瞬时转染技术并辅以逆转录-聚合酶链反应等实验方法研究雷帕霉素对不同生物学特性的人鼻咽癌细胞株生长抑制作用,并通过检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键蛋白标记物揭示细胞生长抑制现象产生的相关机制,接着观察雷帕霉素对HSP70表达下调的鼻咽癌细胞所产生的影响,最后初步探讨HSP70 siRNA与雷帕霉素联合抑制鼻咽癌细胞生长所涉及的相关机制,得出如下结论: 1.雷帕霉素在体外能够一定程度抑制鼻咽癌细胞株的生长,不同细胞株之间抑制率无明显差异; 2.雷帕霉素抑制p-mTOR Ser2448表达和mTOR的激酶活性是导致细胞生长抑制产生的原因; 3.雷帕霉素诱导p-Akt Ser473表达上调是导致药物对鼻咽癌细胞株生长抑制率不高的原因之一; 4.雷帕霉素能够引起部分细胞株p-mTOR Ser2448表达下调,但是这并非反映生长抑制率情况的指标; 5. HSP70 siRNA和雷帕霉素联合使用提高药物对鼻咽癌细胞生长抑制作用; 6. HSP70 siRNA是通过沉默HSP70表达,调控Akt Ser473位点磷酸化水平使雷帕霉素对鼻咽癌细胞抑制率增高,为HSP70 siRNA与雷帕霉素联合靶向治疗鼻咽癌提供了有价值的实验资料。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R739.63

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