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《长沙理工大学》 2014年
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稻米中镉快速检测金标试纸条的研制

苏芳  
【摘要】:65%的中国人以稻米为绝对主食,2002年,农业部稻米及制品质量监督检验测试中心曾对全国市场稻米进行安全性抽检,结果显示,稻米中镉超标率为10.3%。未来中国农产品安全问题中,镉等重金属污染将取代农药,成为事故多发地带。传统的检测方法已不能满足需求,急需找到快速、灵敏、高效的新型检测方法,本论文以稻米中重金属镉为研究对象,以制备单克隆抗体为基础,进一步组装金标试纸条,以期建立现场、快速镉的免疫检测方法。采用大分子双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸(isothiocyano benzy-EDTA, iEDTA)螯合重金属镉离子形成六齿配合物,再分别偶联载体OVA和BSA,合成人工免疫抗原Cd-iEDTA-OVA和检测抗原Cd-iEDTA-BSA。石墨炉原子吸收分光光度计测得Cd-iEDTA-OVA和Cd-iEDTA-BSA中镉含量分别为174.6230μg-L-1和48.1881μg·L-1;紫外分光光度扫描结果表明完全抗原同时具备载体蛋白与半抗原的吸收特性,并测得OVA和BSA含量分别为1.7892mg-mL-/1和1.8065mg·mL-1,结果说明镉完全抗原合成成功,可用于后续试验研究。采用Cd-iEDTA-OVA多点少量注射BALB/c小鼠,获得抗血清,通过细胞融合、杂交瘤及克隆技术获得7F4和7E8两株特异性较好的杂交瘤细胞;通过体内诱生腹水法及辛酸-硫酸铵盐析、差量离心法纯化技术,获得7E8E5、7E8G9、7F488、7F4D6和7F4H85株单克隆抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)结果表明,5株单抗均属IgGl型;亲和力均高,数量级达108;仅与Hg2+有较强交叉,与其他离子几乎无交叉;初步建立了Cd2+间接竞争ELISA法,最低检测限为260ng·mL-1,在260~5000ng·mL-1范围内趋近直线。SDS-PAGE法结果显示有且只有两条清晰的区带(重链带和轻链带),说明单抗纯度高。其中7E8E5和7E8G9效价相对高,分别达1:512000和256000,亲和常数也最高,分别为4.55×1081·mmoL-1和2.20×1081·moL-1,因此可从该两株单抗择优制备金标试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备13nm金颗粒,通过目测、可见-紫外分光光度法、透射电镜法鉴定,结果表明金溶液稳定于酒红色,且呈球形、大小均一,可用于标记7E8G9。通过条件优化得到:最佳标记pH为8.2,最小抗体用量为每1mL胶体金溶液中6.0μg单抗,T线包被浓度为1.0mg·mL-1,C线包被浓度为1.5mg·mL-1,且包被条件为37℃条件下干燥60min,最佳金标抗体稀释度为0.75倍,最佳封闭温度及时间为25℃干燥60min,最佳离子浓度为O.Olmol·L-1。将完全抗原Cd-iEDTA-BSA作为T线,羊抗鼠二抗作为C线,包被于硝酸纤维素膜上,纳米金颗粒标记的7E8G9单克隆抗体包被于金标垫上,组装成定性检测金标试纸条。试纸条的灵敏度为0.2 mg·kg-1、重复性良好、与Hg2+有较强交叉,最高共存浓度不得高于1.0mg·kg-1;与Zn2+有一定交叉,最高共存浓度不得高于10 mg·kg-1;与Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、.Pb2+几乎无交叉;贮存期约为1年。试纸条检测稻米中镉与GFAAS结果基本一致。
【学位授予单位】:长沙理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:TS210.7

【参考文献】
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