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《长沙理工大学》 2015年
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Streptomyces lividans中DndA蛋白的表达纯化及表征

许艳  
【摘要】:DNA是遗传物质的载体,DNA修饰一般发生在组成DNA的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基上。而DNA的磷硫酰化修饰却是发生在DNA骨架磷原子和氧原子间的修饰,因而研究DNA的磷硫酰化修饰具有重大意义。研究发现DNA骨架磷硫酰化修饰与五个基因组成的dnd基因簇(dndA-E)相关。其中dndA基因编码的DndA蛋白,是一类半胱氨酸脱硫酶。2012年邓子新课题组解析了DndA(C/S)的蛋白晶体结构,分析发现与报道的其他半胱氨酸脱硫酶不同的是,DndA(C/S)中活性位点327位的半胱氨酸位于β折叠上,而传统的半胱氨酸脱硫酶活性位点位于loop上,那么这种结构差异是由于活性位点突变引起的?还是说DndA具有一种全新的脱硫机制?为了研究DndA(WT)的结构,本文成功构建了dndA(WT)及活性位点突变型dndA(C327/S)的质粒转化感受态细胞BL_(21)(DE_3),实验得到了DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的上清可溶表达;将DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白通过镍柱、阴离子交换柱柱、凝胶过滤柱等的纯化最终得到了纯度高达95%的蛋白;CD谱图及分析型75表征显示DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的结构整体相差不大。为了证实DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的结构细节差异,及研究DndA的脱硫机制,本文构建了一系列用于DndA部分标记PTS策略体内表达所需的质粒共转化后表达并进行初步纯化实验,实验证明DndA在部分标记PTS策略体内表达后未见明显连接成功的目的蛋白;构建DndA部分标记PTS策略体外表达所需的碳端加His标签的dndA268-380-pSKBAD2质粒转化感受态细胞ER2566表达后上清80%可溶,且对镍柱亲和能力较好,可以进行后续的大量表达和纯化以及标记实验,氮端质粒dndA1-260-pSKDUET01在低浓度咪唑中即被洗脱,扔需后续实验优化表达条件;在DndA部分标记PTS策略没有达到理想效果的情况下,实验对PTS策略中氮端所需质粒进行了改造,希望能实现目的蛋白的快速识别检测;同时构建了DndA蛋白氮端和碳端质粒,希望在没有氮端和碳端小肽辅助时,通过孵育来实现连接。
【学位授予单位】:长沙理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q78

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