收藏本站
《长沙理工大学》 2015年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Streptomyces lividans中DndA蛋白的表达纯化及表征

许艳  
【摘要】:DNA是遗传物质的载体,DNA修饰一般发生在组成DNA的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基上。而DNA的磷硫酰化修饰却是发生在DNA骨架磷原子和氧原子间的修饰,因而研究DNA的磷硫酰化修饰具有重大意义。研究发现DNA骨架磷硫酰化修饰与五个基因组成的dnd基因簇(dndA-E)相关。其中dndA基因编码的DndA蛋白,是一类半胱氨酸脱硫酶。2012年邓子新课题组解析了DndA(C/S)的蛋白晶体结构,分析发现与报道的其他半胱氨酸脱硫酶不同的是,DndA(C/S)中活性位点327位的半胱氨酸位于β折叠上,而传统的半胱氨酸脱硫酶活性位点位于loop上,那么这种结构差异是由于活性位点突变引起的?还是说DndA具有一种全新的脱硫机制?为了研究DndA(WT)的结构,本文成功构建了dndA(WT)及活性位点突变型dndA(C327/S)的质粒转化感受态细胞BL_(21)(DE_3),实验得到了DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的上清可溶表达;将DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白通过镍柱、阴离子交换柱柱、凝胶过滤柱等的纯化最终得到了纯度高达95%的蛋白;CD谱图及分析型75表征显示DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的结构整体相差不大。为了证实DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的结构细节差异,及研究DndA的脱硫机制,本文构建了一系列用于DndA部分标记PTS策略体内表达所需的质粒共转化后表达并进行初步纯化实验,实验证明DndA在部分标记PTS策略体内表达后未见明显连接成功的目的蛋白;构建DndA部分标记PTS策略体外表达所需的碳端加His标签的dndA268-380-pSKBAD2质粒转化感受态细胞ER2566表达后上清80%可溶,且对镍柱亲和能力较好,可以进行后续的大量表达和纯化以及标记实验,氮端质粒dndA1-260-pSKDUET01在低浓度咪唑中即被洗脱,扔需后续实验优化表达条件;在DndA部分标记PTS策略没有达到理想效果的情况下,实验对PTS策略中氮端所需质粒进行了改造,希望能实现目的蛋白的快速识别检测;同时构建了DndA蛋白氮端和碳端质粒,希望在没有氮端和碳端小肽辅助时,通过孵育来实现连接。
【关键词】:半胱氨酸脱硫酶 DNA磷硫酰化修饰 表达与纯化 部分标记
【学位授予单位】:长沙理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 摘要5-6
  • ABSTRACT6-10
  • 第一章 前言10-18
  • 1.1 半胱氨酸脱硫酶的结构研究进展10-11
  • 1.2 半胱氨酸脱硫酶脱硫机制研究11-12
  • 1.3 硫原子的转移12
  • 1.4 半胱氨酸脱硫酶的功能介绍12-17
  • 1.4.1 用于铁硫簇的合成12-13
  • 1.4.2 与铁硫簇相关的含硫生物分子的合成13
  • 1.4.3 tRNA硫修饰13-14
  • 1.4.4 硫胺素的合成14-15
  • 1.4.5 DNA的磷硫酰化修饰15-16
  • 1.4.6 喋呤型钼辅因子的合成16-17
  • 1.5 课题研究目的和意义17-18
  • 第二章 dndA及突变体质粒的构建18-23
  • 2.1 实验材料18-19
  • 2.1.1 质粒、模板及工程菌株18
  • 2.1.2 质粒构建中主要仪器及试剂18-19
  • 2.2 实验方法19-21
  • 2.3 实验结果21-22
  • 2.4 小结与讨论22-23
  • 第三章 DndA及其突变体蛋白的表达纯化23-37
  • 3.1 实验材料23-24
  • 3.1.1 实验相关仪器23
  • 3.1.2 试验相关试剂配制23-24
  • 3.2 实验方法24-28
  • 3.2.1 转化表达型细胞BL_(21)(DE_3)24
  • 3.2.2 小量表达优化24-25
  • 3.2.3 大量表达及纯化25-28
  • 3.2.4 蛋白浓度的测定28
  • 3.3 实验结果28-35
  • 3.3.1 DndA(WT)蛋白的表达纯化28-31
  • 3.3.2 DndA(C/S)蛋白的表达纯化31-35
  • 3.4 小结与讨论35-37
  • 第四章 DndA及其突变体蛋白的表征37-41
  • 4.1 实验材料37
  • 4.2 实验方法37-38
  • 4.2.1 圆二色谱(即CD谱)的表征37
  • 4.2.2 分析型(Analysis)75的表征37-38
  • 4.3 实验结果38-39
  • 4.3.1 CD谱结果分析38-39
  • 4.3.2 Analysis 75谱图分析39
  • 4.4 小结与讨论39-41
  • 第五章 部分标记DndA样品的制备41-61
  • 5.1 前言41-45
  • 5.1.1 部分标记简介41-42
  • 5.1.2 部分标记原理42-43
  • 5.1.3 DndA部分标记策略的选择及操作方法43-44
  • 5.1.4 DndA部分标记的研究目的及意义44-45
  • 5.2 DndA部分标记PTS策略的体内表达45-52
  • 5.2.1 DndA部分标记PTS策略体内表达质粒的构建策略45
  • 5.2.2 DndA部分标记PTS策略体内表达质粒的构建45-47
  • 5.2.3 DndA部分标记PTS策略体内表达重组质粒的表达检测47-48
  • 5.2.4 DndA部分标记PTS策略体内表达的连接条件优化48-49
  • 5.2.5 DndA部分标记PTS策略体内的大量表达及初步纯化49-51
  • 5.2.6 小结与讨论51-52
  • 5.3 DndA部分标记PTS策略的体外表达52-55
  • 5.3.1 DndA部分标记PTS策略的体外表达质粒构建策略52
  • 5.3.2 碳端加His标签的dndA_(268-380)-pSKBAD2质粒的构建52
  • 5.3.3 dndA_(1-260)-pSKDUET01质粒的表达与初步纯化52-54
  • 5.3.4 碳端加His标签的dndA_(268-380)-pSKBAD2质粒的表达与初步纯化54
  • 5.3.5 小结与讨论54-55
  • 5.4 DndA部分标记的PTS策略中氮端质粒的改造55-56
  • 5.4.1 dndA_(1-260)-pSKDUET01的改造策略55-56
  • 5.4.2 氮端带Flag标签的dndA_(1-260)-pSKDUET01质粒的构建56
  • 5.4.3 小结与讨论56
  • 5.5 以pET28a为载体的dndA分段表达质粒的构建56-61
  • 5.5.1 以pET28a为载体的dndA分段表达质粒构建策略56-57
  • 5.5.2 以pET28a为载体的dndA分段表达质粒的构建57
  • 5.5.3 dndA_(1-260)-pET28a质粒、氮端加Flag标签的dndA_(1-260)-pET28a质粒的表达与初步纯化57-59
  • 5.5.4 dndA_(268-380)-pET28a重组质粒的表达与初步纯化59-60
  • 5.5.5 小结与讨论60-61
  • 第六章 总结与展望61-63
  • 参考文献63-67
  • 致谢67-68
  • 附录A 攻读硕士学位期间研究成果68-69
  • 附录B69-72

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 马挺;佟明友;张全;梁凤来;刘如林;;脱硫菌Fds-1的分离鉴定及其对柴油脱硫特性的研究[J];微生物学报;2006年01期
2 刘波;熊健;吕浩;何冰芳;应汉杰;;生物质对红球菌属菌株lawq生长和脱硫酶活力的影响[J];化学工程;2005年06期
3 吴根福;王莹;;铁硫簇的生物合成[J];细胞生物学杂志;2007年03期
4 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 张倩倩;马洁;王长水;;硫酸根对脱硫菌生长脱硫影响的研究[A];中国化学会第九届全国应用化学年会论文集[C];2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 葛玉凤;重组复合脱硫酶的构建及高效表达[D];石河子大学;2016年
2 许艳;Streptomyces lividans中DndA蛋白的表达纯化及表征[D];长沙理工大学;2015年
3 刘倩;氧化亚铁硫杆菌及嗜酸硫化芽孢杆菌半胱氨酸脱硫酶的分子及功能鉴定[D];中南大学;2011年
4 白雪晶;硫酸盐对Rhodococcus sp. LY822脱硫代谢影响的研究及脱硫基因的克隆表达[D];中国农业科学院;2007年
5 言海燕;一株脱硫微生物的选育及其脱硫性能的研究[D];天津大学;2006年
6 吴安娜;嗜酸氧化亚铁硫杆菌中半胱氨酸脱硫酶IscS的表达、纯化及酶学性质研究[D];中南大学;2009年
7 陈彦波;鹦鹉热嗜衣原体半胱氨酸脱硫酶CPSIT_0959的结构和相关功能初步研究[D];南华大学;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026