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《湖南农业大学》 2011年
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转rol ABC基因枳橙砧木的评价

袁飞荣  
【摘要】:柑橘是我国重要的果树,培育矮化砧木和接穗品种一直是柑橘育种的重要目标之一。柑橘天然矮化砧木种质极少,传统育种因面临漫长的童期、高度杂合,以及珠心胚干扰等问题,目前进展缓慢。应用矮化基因,通过基因工程技术将一个或多个基因转入到柑橘基因组中,可望加快柑橘砧木矮化育种的进程。 rol ABC基因克隆于Agrobactecium rhizogenes菌A4的Ri质粒的TL-DNA区,转入rol基因可诱发植株出现节间变短,分枝增多,顶端优势散失,大量毛根形成,植株显著矮化等性状,rol基因的表达与植物矮化性状形成关系密切,其诱发的大量毛状根在提高植物抗逆性方面引起重视,通过遗传转化技术将rol基因转入林木和果树砧木的研究近年来已有报道。 枳橙[Citrus sinensis (L.) Osb x Poncirus trifoliate (L.) Raf.]是一种重要的柑橘杂交砧木,因具有抗柑橘衰退病和脚腐病特性,在欧美国家已成为新兴的柑橘砧木被大力推广应用,如进一步改良获得矮化、抗性枳橙将有更大的应用价值。 本实验室及合作者通过农杆菌介导法己将rol ABC基因转入Troyer枳橙中,并通过组织培养繁殖B、D、E三个转rol ABC基因枳橙株系,转基因枳橙表现出典型的rol基因性状,根系也产生大量毛状根。在此基础上,本研究系统阐述了转rol ABC基因枳橙的分子基础、形态特征、生理特性、外源基因表达模式变化,并研究其用作基砧、中间砧对柑橘接穗生长发育的影响,探索转rol ABC基因枳橙自身及诱导接穗矮化的机理,并按照农业部转基因安全办要求,对转rol ABC基因枳橙砧木的安全性进行了综合评价。主要研究结论如下: 1、PCR、Southern杂交鉴定确定,rol ABC基因已经转入到Troyer枳橙,B,D系插入一个拷贝,E系中插入两个拷贝,Semi-RT PCR和qRT PCR证实rol A、rol C基因在转基因B、D、E系中均能正常转录表达,其中rol C基因表达量最高,其次是rol A基因,rol B基因转录水平十分微弱。 2、转rol基因枳橙及其实生后代表现出典型的rol基因形态特征,E系生长势较旺盛,植株较高,表现出更好的环境适应性,基部分枝相比B、D系更多。三者均表现良好的嫁接亲和力。B、D、E系转基因枳橙具有狭长而密集的导管结构,单位面积细胞数未有减少;光合速率明显高于野生植株,叶绿素含量增加与光合效率提高有密切关系;SOD、POD、Pro均显著提高,多年栽培表现出良好的抗逆性。 3、建立适合于rol A、rol B、rol C基因实时荧光定量RT-PCR分析方法。2009年6月15至9月15,每隔15天,采取转基因枳橙B、D、E系7个组织(芽、幼茎、嫩叶、功能叶、皮、老叶、根),相对定量法分析外源基因的时空表达与植株生长的关系。发现在B、D、E系转rol基因枳橙中,rol C基因表达最强,其次是rol A, rol B基因表达水平最低。rol A、rol C基因表达在6月30日和7月30日呈现两个表达峰值,7月15日呈现一个明显的低谷,并且证实高温抑制生长与rol基因表达下调有关。rol A基因表达主要在老叶、芽、功能叶中表达,rolB基因主要在根系中表达,rol C基因主要在嫩茎、芽和功能叶中表达。取4个时间点,分析rol基因时空表达与矮化性状的相关性发现:植株生长高度减少率(plant height reduced rate, RPHRR)与rol A(r=0.75, p0.01), rol C(r=0.74, P<0.01)基因在韧皮部的转录水平成正相关,除根中rol基因的表达外,rol A、rol C基因在其它6个组织中的表达也直接促进转基因枳橙矮化。 4、转rol基因枳橙既不属于GA缺陷型,也不属于GA不敏感型,喷施GA3能促进其茎伸长生长,但恢复不到野生型水平。幼芽中GA1、GA4和IAA显著降低(P<0.05), POD酶活性显著提高(P0.05)。转rol基因枳橙幼芽中GA20oxl基因mRNA水平相比对照显著下调(P0.01)。在幼芽、嫩茎中,rol C基因与GA20ox1表达负相关。故认为rol基因通过在幼芽中的高表达下调了GA20ox1基因转录表达,进而抑制了活性GAs在幼芽中的合成,顶端分生组织较低量的活性GAs限制植物茎伸长。 5、转rol ABC基因枳橙果实种子变小,且从楔形变成椭圆形,萌发比野生植株晚一周左右。T1代在幼苗期植株就表现出典型的rol基因矮化性状,萌芽率有所下降,99%为珠心苗,生长一致,但主干粗度有所下降。PCR, RT-PCR鉴定确认rol基因在实生后代表达同T0代,认为转rol ABC基因枳橙T1代能稳定遗传rol基因的典型性状。 6、以转rol ABC基因枳橙B、D、E做基砧和中间砧木,嫁接大红甜橙、沙田柚,嫁接4年后,提取接穗DNA进行PCR和qRT PCR分析,确证外源基因不能通过嫁接转移。rol ABC基因枳橙一年生嫁接树光合作用明显提升,四年生嫁接树未见与对照有差别;两个接穗品种均表现12%-30%不同程度的诱导矮化效果;2009年和201O年连续2年果实品质分析发现,E系上嫁接大红甜橙,果实总糖含量分别上升14.2%和19.3%。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S666

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