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《湖南农业大学》 2012年
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甜橙和金柑高效安全转基因技术研究

杨莉  
【摘要】:柑橘转基因研究目前已经获得了许多研究成果,但与其他木本植物一样,存在转基因育种规模化发展滞后的现象。究其原因,主要是遗传转化体系不够完善,外植体多采用幼年材料,延长了转基因育种周期。对转基因技术体系进行优化以及提高成年态材料的转化效率可以有效的解决以上问题,有利于促进柑橘转基因育种的进程。 本研究以金柑和糖橙实生态节间茎段为试材,综合分析影响其再生及转化效率的各种因素,建立了相应的实生态材料高效遗传转化的技术体系。通过温室和试管反复嫁接对成年态外植体进行幼态化处理,有效的降低成年态外植体再生污染率,提高再生率,获得了较高的转化效率。同时,从显微结构、生理特性以及分子水平的变化,探讨柑橘成年态材料幼态化的可能成因。并在优化的遗传转化技术体系基础上,成功将‘外源基因清除’(Gene-Deletor)以及‘果实无核化’基因导入金柑和甜橙中,对转基因株系的外源基因切除情况进行了分析,检验了花粉和种子特异启动子PAB5在柑橘中的特异性,为柑橘的生物安全性研究提供基础。主要研究结论如下: 1金柑再生及遗传转化高效技术体系的建立 以金柑实生苗节间茎段为试材,分析了影响再生的各种因素,结果表明:以35d苗龄(完全暗培养)的实生苗节间茎段为外植体材料,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg/16BA)上培养50d左右,切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg/l IBA+l g/1活性炭)。最终可达到90%左右的不定芽再生率以及86%左右的生根率。 以金柑实生苗节间茎段为试材,分析了影响遗传转化的各种因素,结果表明:以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗节间茎段为外植体,用共培养液体培养基(MS+2mg/16BA+1mg/1NAA+1mg/1KT+100μ乙酰丁香酮,pH=5.4)等体积重悬OD600=0.5农杆菌后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg/16BA+50mg/1卡那霉素+400mg/1头孢霉素)进行阳性芽的筛选,可获得最高的GUS阳性率。应用优化的遗传转化技术体系,成功将'Gene-deletor'和‘果实无核化’基因导入其中,最终获得了6.07%的转化效率。 2糖橙遗传转化技术体系的优化 以糖橙实生苗节间茎段为试材,对影响转化的因素进行研究,结果表明:以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的实生苗节间茎段为外植体,在乙酰丁香酮浓度为100μM、共培养基pH值为5.7以及共培温度为19℃条件下获得了最高的GUS阳性率(29.4%)。抗性芽在伸长培养基(MS+0.2mg/l6BA+0.2mg/l IAA+0.2mg/l GA3)上培养1个月后,95%出现了伸长,平均为2.3cm。转入生根培养基(1/2MS+0.5mg/l NAA+0.1mg/l IBA+1g/l活性炭)可获得80.2%的生根率,根系平均长度为5.83cm。应用优化的遗传转化技术体系,‘果实无核化’基因导入其中,获得的转基因株系已嫁接于温室生长良好。 3柑橘成年态外植体的幼态化处理 在温室中和试管中将成年态芽反复嫁接于实生砧木上进行幼态化处理。结果表明:温室嫁接幼态化处理试验中,成年态材料获得了一定的幼态化效果,其中糖橙和冰糖橙各获得了72.4%和67.7%不定芽再生效率,相比未幼态化处理提高了57%左右。并通过比较发现以酸橙为砧木的成年态甜橙节间茎段的不定芽再生能力高于以枳为砧木,嫁接后第1和第2次梢的不定芽再生率显著高于第3次梢。反复嫁接有利于幼态化的效果;在试管嫁接幼态化处理试验中,通过将试管反复嫁接幼态化处理材料转接于温室,冰糖橙可获得53.2%的不定芽再生率,相比未幼态化处理提高了42.9%。 显微结构观察发现,幼态化处理材料的茎与未幼态化处理在组织结构上未发现明显区别,表明组织结构可能不是造成二者再生能力差异的主要原因。但经过15d离体培养后,在形成层处的细胞增殖量远远大于未幼态化处理材料,说明通过幼态化处理,形成层细胞的分生能力增强。幼态化处理引起了内源激素含量及比率的变化,特别是生长促进类激素GA3、IAA和ZR的上升以及生长抑制类激素ABA的下降,可能导致了幼态化材料不定芽再生能力的增强。DNA的甲基化敏感性扩增多态性分析结果表明,幼态化处理材料与未幼态化处理材料在总DNA甲基化水平上有所下降,进一步对DNA甲基化类型变化进行分析,发现幼态化处理后材料的DNA甲基化减少型明显大于增加型,DNA甲基化程度呈下降趋势,可能启动了不定芽离体再生分子调控中的某些基因的表达,因而提高了不定芽的再生能力。 4幼态化处理后柑橘成年态外植体的遗传转化及'Gene-deletor'基因导入 以幼态化处理后的成年态材料为外植体,将'Gene-deletor'基因导入成年态冰糖橙中,获得了15株转基因株系,转化效率为4.63%,而未幼态化处理材料未获得转基因株系。通过PCR检测证实由35S启动子驱动的nptⅡ基因和由花粉和种子特异性启动子PAB5驱动的重组酶基因FLP都存在于转基因叶片中,但通过RT-PCR和定量PCR检测,发现在叶片中nptⅡ基因表达,而重组酶基因FLP未表达,初步验证了花粉和种子特异性启动子PAB5在柑橘中的适用性。 通过对转基因株系的种子以及所有珠心胚和合子胚进行GUS组织染色,没有检测到GUS蛋白的活性,初步表明外源基因已被清除。为进一步了解'Gene-deletor'载体中组织特异性启动子PAB5在柑橘中启动以及外源基因清除情况,对果实各部分进行GUS基因活性分析。结果表明,与胚发生同属于LⅡ组织发生层的果皮白皮层和部分来源于LⅡ层的汁胞都未观察到GUS染色,而来源于L,层的外果皮和来自Lm层的囊衣以及中柱都表现出了GUS活性,说明在这些组织中外源基因未被清除。证实启动子可以诱导由LⅡ组织发生层形成的器官和组织中外源基因的清除,但不能诱导由LⅠ和LⅢ组织发生层形成的器官和组织中外源基因的清除。'Gene-deletor'技术在柑橘上的应用,为柑橘环境安全转基因研究打下了基础。但柑橘果实的可食部分中还包括未切除外源基因的囊衣,作为转基因食品还存在安全问题,下一步需要筛选果实特异性启动子,将外源基因从花粉、种子和果实中全部清除,从而彻底解决转基因柑橘的食品安全问题。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S666

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【参考文献】
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