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皱边石杉内生真菌的ISSR分析及高产HupA功能内生菌的筛选鉴定

史云峰  
【摘要】:石杉碱甲是一种高效、可逆、特异性强、毒性低的乙酰胆碱酯酶抑制剂,是治疗阿尔茨海默病的首选药物成分,其主要来源为从石杉科植物中直接提取,但在石杉科植物中的含量低,一般为0.2mg/g左右。石杉科植物为小型低等蕨类植物,有2个属,约150种,稀散分布于世界各地,我国有28种,4个变种。一般高10-30cm,主要生长于海拔300-2600m的原始次生林地,伴生于竹子、杉树、苔藓、红槛木、油茶等植物根系周围,生长环境条件阴暗、潮湿,生长缓慢、资源匮乏。寻找新的石杉碱甲来源,缓解当前用药需求就备受人们关注。由于真菌具有易培养、易控制、生产成本低、生长快等优点,容易实现大规模工业化生产,从植物内生菌中寻找和发现新的活性化合物是当前植物内生菌研究的一个热点。本论文在前期研究的基础上,运用微生物学、现代生物技术和生物信息学等相关知识,对皱边石杉内生真菌进行分离纯化、菌丝体DNA的提取,内生真菌ISSR的遗传多样性分析,内生真菌的种属鉴定,利用现代色谱技术对内生真菌发酵产物进行鉴定,进而利用高速逆流色谱制备高纯度石杉碱甲以及目标高产菌株发酵优化工艺研究,主要研究结果如下: (1)获得了皱边石杉内生真菌DNA快速有效提取方法。采用氯化苄法提取其总DNA,对比研究了石英砂研磨与超声波振荡2种破壁方式提取DNA的效能。结果表明,采用超声波只需10分钟破壁,较石英砂研磨更快捷、更高效。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳、ITS序列扩增,表明超声波破壁法提取的DNA较石英砂研磨法更能获得良好的PCR扩增结果。超声波提取法可作为植物内生真茵DNA大规模快速提取方法,尤其对质地坚硬的菌落较石英砂研磨更有效。 (2)获得了皱边石杉内生真菌ISSR-PCR最优反应体系、内生真菌遗传多样性及与宿主的亲缘关系。皱边石杉内生真菌ISSR-PCR最优反应体系为:25μL反应体系中,10×PCR Buffer(Mg2+浓度为2.0mmol/L)2.5μL, dNTPs(10mmol/L)0.6μL,引物(10pmol/μL)2.0μL, Taq E(1U/μL)1.5μL, DNA模板(10ng/μL)3μL,无菌ddH2O15.4μL。可获得稳定性高,重复性好,背景清晰的ISSR扩增结果。通过优化筛选的10条ISSR引物对皱边石杉内生真菌进行遗传多样性分析,共扩增出3975条清晰条带,多态性条带占100%。遗传相似系数为0.59~0.96,在0.64水平,可分为11类;在0.67水平,第Ⅰ类又可分为5个亚类,说明皱边石杉内生真菌资源遗传多样性高,遗传距离较远,遗传基础较宽。以UBC868对皱边石杉植物样本DNA进行扩增,在500bp、350bp、200bp处均有清晰扩增条带,其中13号菌株在500bp、200bp均有清晰的扩增条带,可获知13号菌株与宿主植物存在某些基因序列相同的片段,与13号菌株同属一类的内生真菌可作为石杉碱甲生产的潜力菌株进行重点筛选和诱变。 (3)对从皱边石杉分离出的内生真菌发酵产物进行薄层色谱和高效液相色谱分析,并对目标产物进行了高速逆流制备。通过薄层色谱分析,初步推断1、4、5等38个菌株代谢产物中可能含有石杉碱甲或与其结构相似的化学成分。高效液相色谱进一步检测,13、87号菌具有良好的生产石杉碱甲或其类似物的功能,其产量分别为199.6μg/L和18.64μg/L。高速逆流色谱对13、87号菌株发酵液进行检测,分离出了高纯度的目标物质——石杉碱甲。高速逆流分离制备方法为:正己烷-正丁醇-水(3:1:2)为溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,流速为2mL/min,转速为800r/min,进样量为5mL。筛选出了NKA-2大孔吸附树脂为静态吸附的优选树脂,为大规模生产石杉碱甲提供了技术参考。 (4)对薄层色谱检测可能生产石杉碱甲或与其结构与之相似的化学成分的菌株,进一步ISSR分析,去除重复样本得到19个菌株,在形态学鉴定的基础上进行核糖体rDNA ITS序列鉴定, www.ncbi.nlm.nih.gov在线BLAST,与GenBank、EMBL、DDBJ、PDB多个核酸数据库进行同源性比对,绘制系统发育树。用p-distance模式计算遗传距离,邻位相连法进行进化距离分析,确定了19个菌株的种属,其中13号菌为胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的一种,87号菌为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的一种。将5、11、12、13、15、16、19、28、37、38、40、44、51、57、65、77、87、88、1号菌株的ITS序列提交GeneBank,获得Accession No分别为:JX230994、JX230995、JX230996、JX230997、JX230998、JX230999、JX231000、 JX231001、JX231002、JX231003、JX231004、JX231005、JX231006、JX231007、 JX231008、JX231009、JX231010、JX231011、JX231012。 (5)以13号菌为供试菌株,对其发酵生产石杉碱甲工艺进行了优化筛选,其最佳发酵条件为:1L马铃薯液体培养体系中加20g麦芽糖,pH值为自然值(5.0),摇床转速150r/min,28℃恒温培养84h,在放大培养后用HPLC检测含量达0.1996gg/mL。


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