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《湖南农业大学》 2014年
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白藜芦醇对乌骨鸡热应激损伤的修复机制研究

刘丽莉  
【摘要】:全球温度升高和高密度集约化养殖伴随而来的热应激问题是制约家禽生产的一个重要因素,给畜牧业带来很大的经济损失,而研究热应激对家禽的损伤特征、规律及开发缓解热应激的天然添加剂将对畜禽生产具有重要意义。本试验选取体重相近的42日龄雪峰乌骨鸡300只,随机分成5组,每组6个重复。常温组(NT,24±2℃)和热应激组(HT,37±2℃)饲喂基础日粮,其余3组为热应激条件下在基础日粮中添加200、400和600mg/kg白藜芦醇(HT+Res200、HT+Res400和HT+Res600组),持续试验15d。研究了热应激对乌骨鸡生产性能、生化指标、抗氧化酶活性、免疫器官指数和小肠形态学等方面的影响以及日粮中添加白藜芦醇对乌骨鸡热应激损伤的修复效果;采用免疫组化、Western-blot和荧光定量PCR等方法,检测了HSP70/90、NF-kB和EGF蛋白在空肠黏膜中的分布、定量及其mRNA的表达变化。通过挑选共用父本家系中的42日龄乌骨鸡(全同胞+半同胞)27只,按全同胞分成3组(NT组、HT组和HT+Res400组),以半同胞作为试验重复组,持续试验6d。运用Agilent鸡基因芯片和:nicroRNA测序等方法,筛选乌骨鸡空肠黏膜中与热应激相关的基因及其信号通路,分析microRNA作用于靶标基因的相互关系,研究了白藜芦醇对乌骨鸡热应激相关基因表达的影响。主要结果如下: 1白藜芦醇对热应激乌骨鸡生产性能和血液生化指标的影响 日粮中添加白藜芦醇提高了热应激乌骨鸡的平均日增重和采食量,降低了料重比(P0.05);显著增加全净膛率和腿肌率(P0.05),但对屠宰率和胸肌率差异不显著(P0.05)。热应激引起了血液生化指标和激素水平的紊乱,白藜芦醇对乌骨鸡血糖和总蛋白的提高趋势主要从热应激第6d开始,对血脂的降低主要发生在热应激第10d和第15d,而日粮添加400、600mg/kg白藜芦醇为显著水平(P0.05);白藜芦醇降低热应激3d后血清CK、LDH和ALT活性,而AST活性在应激第10d后以添加量400、600mg/kg白藜芦醇达到显著降低的水平(P0.05);白藜芦醇明显降低了热应激3d后血清CORT含量而增加了IGF-I含量,T3和T4的含量分别在热应激第6d和第10d后显著提高(P0.05),GH的含量在热应激第6d、15d显著上升(P0.05)。说明白藜芦醇能够改善热应激条件下乌骨鸡的生产性能并有效调节其内分泌机能。 2白藜芦醇对热应激乌骨鸡抗氧化功能和免疫器官中HSP27/70/90mRNA表达的影响 热应激明显降低了乌骨鸡抗氧化酶活性(SOD、CAT和GPX)和GSH含量,增加了MDA含量。在热应激第1d或第3d,日粮中添加白藜芦醇对乌骨鸡抗氧化酶活性和GSH含量变化无明显的规律性;而热应激第6d或第10d后,白藜芦醇可以有效降低乌骨鸡血清中MDA的含量,增加GSH的含量并提高SOD、CAT和GPX的活性(P0.05),添加量以400]mg/kg较为明显。与常温组相比,热应激组(第15d)的乌骨鸡法氏囊和脾脏指数显著降低(P0.05),相应组织器官的HSP27、HSP70和HSP90mRNA表达水平显著上升(P0.05),通过在日粮中添加白藜芦醇能有效改善由热应激引起的免疫器官生长抑制,参与调控热应激乌骨鸡的免疫应答反应,而这种调控可能通过动员酶类和非酶类抗氧化系统以清除活性氧自由基并诱导免疫器官中热休克蛋白的表达水平来共同实现的。 3白藜芦醇对热应激乌骨鸡肠黏膜HSP70/90、NF-kB和EGF mRNA表达及蛋白分布的影响 伊红(H·E)染色的结果表明,热应激(15d)明显损伤乌骨鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛结构,导致小肠绒毛变短、隐窝变深及V/C值下降,杯状细胞和淋巴细胞减少。白藜芦醇改善各肠段绒毛形态结构并增加杯状细胞和淋巴细胞的个数,起到热应激损伤修复的作用。与常温条件相比,热应激引起空肠黏膜HSP70、HSP90和NF-kB表达升高,EGF表达降低,其中HSP70和HSP90表达量在热应激第3d达到极显著水平(P0.01),NF-kB和EGF表达量分别在第6d、10d达到极显著水平(P0.01)随着热应激时间延长,白藜芦醇对HSP70、HSP90和NF-kB表达有降低趋势,而EGF明显升高(P0.05)。Western blot检测发现,乌骨鸡空肠黏膜中HSP70表达量在热应激第6d和15d均显著增加(P0.05), EGF则降低(P0.05)。免疫组化实验结果显示,热应激(15d)对空肠粘膜HSP70、HSP90和NF-kB的阳性信号强度明显增加,EGF则明显降低;白藜芦醇不同程度的降低HSP70、HSP90和NF-kB的阳性信号分布,增加EGF的阳性信号,可能诱导EGF表达从黏膜固有层向绒毛上皮细胞转移的趋势。 4热应激对乌骨鸡空肠黏膜中基因表达谱的影响及白藜芦醇对差异基因的调控作用 本试验利用代表了43,803个鸡基因和转录本的Agilent Chicken Oligo Microarray芯片来分析全同胞乌骨鸡空肠黏膜的基因表达谱。结果表明,差异表达基因为132个,其中上调90个,下调42个(FC1.5或-1.5;P0.05),挑选5个基因(PDK4、ENPEP、 P20K、CXCL13L2和ALDH1A2)进行RT-PCR验证,结果表明与基因芯片结果相符。结合GO分类,差异表达基因主要参与发育过程、多细胞刺激应答、氧化系统平衡、神经细胞分化、免疫和胞外区域应答等不同的生物学途径,并推断这些基因在热应激过程中发挥作用。差异表达基因还涉及了3个信号通道,分别为细胞色素P450的酶促途径、ECM受体互作通路和MAPK通路,并参与了体内物质代谢、细胞外基质受体互作、细胞增殖分化、再生或凋亡等生物学事件。荧光定量PCR结果表明,白藜芦醇诱导热应激乌骨鸡PDK4和ENPEP下调,P20K, CXCL13L2和ALDH1A2上调,参与调节热应激乌骨鸡空肠黏膜的修复作用。 5热应激对乌骨鸡空肠黏膜nicroRNA表达的影响及白藜芦醇的调控作用 基于Solexa测序法对热应激乌骨鸡空肠黏膜microRNA进行差异表达分析,以P0.05且FDR0.5为筛选条件,差异表达microRNA有36个,其中上调12个,下调24个。以log2FC≥1.5或≤-1.5倍以上,P0.05且FDR0.5为筛选条件,发现显著下调microRNA有3个,分别为miR-451、miR-146a-5p和miR-10a-5p,经RT-PCR验证与microRNA测序结果相符。应用sRNA Toolkit软件包预测并筛选出1个具有显著上调的novel microRNA,确定二级结构和全长序列(TTTCTGGTACAGTGACTCGAGC)。利用miRBase和TargetScan数据库关联microRNA的靶基因综合分析,预测出:niR-10a-5p的靶基因71个,miR-146a-5p靶基因105个,novel microRNA靶基因652个。通过GO分类,发现miR-10a-5p预测的靶基因涉及小脑皮层形成、转录负调控等;miR-146a-5p预测靶基因涉及硫醇酯水解酶和泛素酶活性、细胞骨架及细胞器组成、大分子代谢等;novel microRNA预测的靶基因主要富集神经递质受体代谢、淋巴细胞的免疫调控、蛋白分解、细胞内离子平衡、发育进程、酶系统平衡、细胞通道等生理活动现象。miR-10a-5p预测靶基因参与的Pathway主要有NF-kB活化通路、TGF-p信号通路、Wnt蛋白信号通路; novel microRNA预测靶基因参与的Pathway主要有ECM受体互作通道、ErbB通路和钙离子信号通路。通过荧光定量PCR分析发现,白藜芦醇能够启动热应激乌骨鸡空肠黏膜中miR-10a-5p和miR-146a-5p的表达上调,从而推断白藜芦醇能抑制相关炎症因子、热休克蛋白和凋亡等基因表达,并提高相关的生长因子、ATP酶和神经调节因子的表达水平来抵抗热应激反应和促进细胞增殖和修复。 本文通过“生长性能--生化指标--组织形态学--mRNA表达水平-microRNA--对应的靶基因”的研究路线,发现热应激造成了乌骨鸡生产性能下降、内分泌功能失调、免疫机能及抗氧化能力减弱等并使肠道黏膜产生一定程度的损伤;而白藜芦醇能启动miR-10a-5p和miR-146a-5p表达上调,诱导PDK4和UENPEP等下调,以及P20K、CXCL13L2和,ALDH1A2等上调,通过增强乌骨鸡抗氧化酶防御系统和调节内分泌机能、免疫应答反应来改善生长性能、胴体性状和肠道形态学结构,从而对乌骨鸡的热应激损伤起到修复作用。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S853.7

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