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《湖南农业大学》 2000年
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辣椒高效离体再生与遗传转化体系建立及抗病转基因研究

黎定军  
【摘要】: 辣椒(Capsicum annuum L.)是一种非常重要的蔬菜作物,其营养价值和经济 价值众所周知。但由于各种病害的危害,辣椒的产量和品质受到严重影响。因此, 提高其抗病性已成为重要的研究课题。生物工程技术为辣椒进行遗传改良提供了 新途径。通过抗病目的基因的导入,获得转基因抗病植株,从中选育出抗病、丰 产、优质的辣椒新品种。近年来,国内外这方面的研究较多,但成功例子很少。 辣椒抗病基因工程发展的最大障碍是辣椒离体再生困难,以致遗传转化率 太低。本研究以17个甜(辣)椒品种为试材,分别就基因型、培养基成分、外植 体生理状态等对子叶离体再生的影响进行了较为系统而深入的探讨,建立起辣椒 子叶高效植株再生体系。在此基础上,通过对外源基因转化辣椒的转化培养条件、 转化方法的摸索,建立起高效遗传转化体系。 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是目前研究得最多的抗真菌蛋白,己经有许 多利用这两种酶基因获得抗真菌转基因植株的报道。本研究将来自菜豆的几丁质 酶基因和来自橡胶的β-1,3-葡聚糖酶基因导入甜(辣)椒,以抗真菌病害。通过 分子检测,证实这两个基因整合到辣椒染色体基因组。 本研究主要研究结果摘要如下: 1、不同苗龄的子叶再生能力有差异,12d的子叶再生能力最强,为剪取外 植体的最佳时期。 2、不同基因型其子叶再生能力不同,17个供试甜(辣)椒品种中,以中椒2 号、中椒5号、中椒6号及湘研十号再生能力最强。 3、不同激素组合及配比对辣椒子叶再生有不同影响。6-BA在芽分化中的作 用优于ZT,1.0mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA导致最高芽分化率。5.0mg/L 6-BA不 能引至芽的伸长,3.omg/L 6oA适于芽的伸长。GA3对芽分化有抑制作用,但 其在芽伸长中不可缺少,2.omglL为最佳水平。 ’8s维生素在辣椒子叶芽分化和芽伸长中优于 MS维生素。10.omg/L AsNO3 能很好地控制外植体的褐化,促进芽分化和芽伸长。 s、oz添加物能极显著地提高芽分化率和芽伸长率,最适用量为5000.omg/L。 6、通过系统研究。我们发现了辣椒离体再生的3个高效培养基: 一 芽分化培养基 PD13:MB+IAAI.0+6BAS.0+DJ5000.0+AgNO。10.0(平均芽 分化率为92%) 一伸长培养基 PE7:MB+IAAI.0+6BA30+GA。2.0+DJ5000.0+AgNO。10.0 (最高伸长率为78.9%) 一生根培养基P*7:M卜1**02 +N+N**01(平均生根率为90叨 7、首次建立起辣椒子叶高效植株再生体系,从外植体接种到完整再生小苗 获得,大约为60天。 8、农杆菌感染前预培养,感染后共培养以及共培养后的延迟选择均有利于 遗传转化效率的提高,其最佳时间均为2天。 9、首次证实,农杆菌接种适宜时间为口-16min。 10、首次采用基因枪法与农杆菌介导相结合转化辣椒,并分别通过农杆菌介 导法和基因枪干农杆菌介导法建立起两种辣椒子叶高效遗传转化体系。发现基因 枪+农杆菌介导转化辣椒的转化率(57%)明显高于单用农杆菌介导的转化率 (41、4%)。 11、首次将几丁质酶基因和 p—l,3一葡聚糖酶基因导人辣椒,通过 PCR和 Southern杂交检测,获转基因植株成株26株,转基因小苗ZI株。
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