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《湖南农业大学》 2002年
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外源几丁质酶基因转化水稻的研究

何迎春  
【摘要】: 水稻是最主要的粮食作物主一,在全球广泛种植。全世界有80%的人口以水稻作为主粮。但其生产受病害的限制,特别是水稻纹枯病和稻瘟病这两种主要真菌病害,发生面积广且危害严重,每年造成水稻减产10%以上,少数地区达40%,甚至绝收。因此,减少病害对产量的影响是保证粮食增产的主要途径之一。控制真菌性病害的方法主要是使用杀菌剂和利用抗病品种。但杀菌剂给人类的生存带来隐患,不利于可持续发展。因此,利用抗病品种减轻病害的发生,无疑是最经济、最有效的方法。 1986年美国孟山都公司利用转基因技术获得了第一株抗病毒病的转基因烟草植株,拉开了转基因育种的序幕。自那以来,已有10多个抗病基因被克隆并转入到不同植物中。 几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,几丁质是植物病原真菌细胞壁的主要成分。现已报道外源几丁质酶基因导入烟草、菜豆、番茄等植物后得到了抗病转基因植株。所以将外源几丁质酶基因导入植物,让其组成型表达几丁质酶基因,是提高水稻抗病性的可能途径。 目前,将外源基因导入水稻的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法和花器介导法(花粉管通道法)。花器介导法是我国分子生物学家周光宇教授所提出的一种转化方法,在我国已得到广泛应用并取得了很大的经济效益、社会效益和生态效益。但国外专家、学者认为该方法似乎存在着太多的偶然因素。因此进一步探讨、分析外源DNA经花器进入植物受体DNA并整合的可行性是很有必要的。 本研究首次利用花器介导法将粘质沙雷氏菌几丁质酶基因和烟草几丁质酶基因转入水稻,进行分子生物学检测、GUS活性检测和抗病性鉴定,得到了对纹枯病和稻瘟病抗性提高的水稻材料。主要研究结果如下: 1、构建了两个含几丁质酶基因的水稻专用转化质粒:将粘质沙雷氏菌几丁质酶基因(SchiA)和烟草几丁质酶基因(TchiB)加上CaMV 35S启动子和Nos终止区,连接到双元载体pCAMBIA1301上,构建成分别含SchiA和TchiB的植物表达质粒pBG1112和pB61121,并对其进行限制性酶切检验、PCR检验、几丁质酶活性检验和序列分析。 2、首次建立了一个可行的花器介导法导入外源目的基因的水稻转化体系,该体系包括: 1)适宜于花器介导法的受体品种:湘粳2号、IR72、优丰162、湘晚籼10号、 博士学叵论文 外源几丁质酶基因转化水稻的研究 中文摘要 南京3015、南京152,W377,丰优早11号,丰优108和佳禾早占。 2)高效的水稻转化载体:PCANBIA1301(该载体T-DNA区有潮霉素选择标记基 因 hSS”和 Sus报告基因) 3)合适的转化条件:转化水稻的最佳时期为水稻授粉后1~3h;每朵颖花滴注 10u质粒 DNA溶液(浓度为 105《40n s汕\ 套白色羊皮袋隔离比套褐色牛皮袋 好;转化可在30.4℃进行,要求相对湿度应高于79%。 4)有效的筛选转基因水稻植株的方法:50mg儿的潮霉素是筛选的最适浓度, 潮霉素对同一品种的糙米的筛选效果比对未去壳种子好,不同温度下潮霉素对同一 品种的抑制作用存在差异,转化水稻筛选的最适温度为28’C。 与以往的水稻转化体系比较,该体系操作方便简单、成本较低、重复性较好。 适应性强,可应用于水稻不同目的的转基因育种。 3、首次确立了可靠的转基因水稻检测体系: 1)分子生物学的检测:对转基因植株进行 PCR、RT干CR检验,将 RT干CR产物 克隆到卜载体上进行测序,经BLAST软件比较相似性。对转细菌几丁质酶基因的 RT-PCR产物测出的核昔酸序列经BLAST检索GeneBank数据库,找到的相似核昔酸 序列只有细菌几丁质酶基因的,没有植物几丁质酶基因核昔酸序列,证明了RT-PCR 产物不是假阳性,亦证明外源基因己整合到受体基因组中,表达出 mRNA并加工为成 熟 mRNA。 2)抗病性鉴定:人工接种鉴定转基因水稻对纹枯病和稻瘟病的抗性,获得了抗 性显著提高的 T;代转细菌几丁质酶基因水稻株系,特别是舢稻优丰 162对稻瘟病的 抗性主感病(9级)提高到抗病门级)。 3)GUS活性测定:随机检测转基因水稻 T。代部分植株中 GUS活性,转基因 T。 代植株GUS活性比阴性对照高得多,即转基因植株中含外源gSS基因且能表达,外 源部基因己经稳定遗传至第四代。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S511.035.3

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