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几种植物病原原核生物实时荧光PCR检测方法的研究

廖晓兰  
【摘要】: 细菌、植原体是两类重要的植物病原原核微生物,能导致许多农作物及林木花卉严重减产、绝收甚至物种大范围死亡。它们当中许多种在我国已有发生,也有相当一部分在我国没有分布,对我国农业及生态环境构成极大威胁,已列为或需要列为检疫的有害生物。 传统的细菌分类、检测和鉴定,主要依靠人工培养、寄主范围等理化生物学特征,不准确,难以标准化,更有甚者往往造成分类上的不稳定和混乱。而植原体和一部分细菌不能培养,以致长期以来无法进行有效的分类和检测鉴定。近年来国内外利用16SrDNA等保守基因进行分子进化研究,为这两类病原检测鉴定提供了重要理论依据。尤以实时荧光PCR是国际上近年发展起来的新技术,即在普通PCR方法的基础上,加入了一条荧光标记的探针,利用荧光信号积累,实时监控整个PCR过程,提高了检测的准确度、灵敏度和检测速度,被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方法。仅历时10年该方法已广泛应用人类病原菌检测。1999年Bohm首次将实时定量PCR方法应用于对植物病原真菌的检测。该方法在植原体上的应用,迄今国内外还未见报道,而用于植物病原细菌的检测鉴定,仅国外有5篇报道,国内未见报道。 本研究中,选择了植原体、柑桔黄龙病病菌、水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌作为研究对象,其共同特点为:均为检疫性有害生物;不能培养菌、难培养菌和可分离培养的菌,涵盖了原核生物的所有类群;为实际工作中检测鉴定的难题。本研究采用第三代分子标记即根据基因点突变和单核苷酸多态性(SNP)的差异设计TaqMan探针。初步建立了植原体、细菌实时荧光PCR检测鉴定方法体系框架。并利用样品进行了实际检测,证明是一种简单、快速、灵敏、准确检测鉴定原核生物的新方法。为其他植物病原微生物检测鉴定研究提供了新思路,为农业和植物检疫部门提供了可靠的技术支持和科学保障。 主要研究结果如下: 1.提出了比较系统和完整的原核生物分子鉴定分类的筛选体系。其技术路线为:在前人工作的基础上,根据GeneBank中所有植原体或细菌的16SrDNA等保守区设计植原体和细菌通用引物和广谱探针,由此可将待检测样品区分为植原体或细菌两大类;同理,在通用引物对扩增片断区间,找出植原体组内保守而组间基因序列具稳定性点突变区,细菌找出属内或种内保守而属内,种内或变种间序列具稳定性点突变区,分别设计植原体小组 g(种)或细菌属、种和变种的特异性探针。 2·在国际国内首次根据16SrDNA自行设计合成了实时荧光PCR检测的ThQMan高效 Z 检测探针6个,其中植原体广谱探针1个,组特异性探针4个,细菌广谱性探针1个,柑 Z 桔黄龙病菌特异性探针1个。其探针序列均己申请专利保护。 Z3.水稻白叶枯菌和水稻细菌性条斑病菌为高度近似种,其16SrDNA,16s上3SrRNA 间区,IS扦入序列等常用靶基因,两菌完全相同。在世界上首次选用含铁细胞接受子 Z 基因作为植物病原细菌分子诊断中的靶基因,设计合成了1个水稻白叶枯菌特异性探针, 1个水稻细菌性条斑病菌特异性探针,用于实时荧光PCR检测和鉴别区分该两种病原菌。 g 其探针序列均己申请专利保护。 4.在国内首次成功克隆并测定了中国柑桔黄龙病病原 16SrDNA基因序列,经同源性 g 比较,表明属于柑桔黄龙亚洲种中一个新株系。其测序的 165 rDNA序列片段已被 Genebank g 收录,其登录号为AY192576。 5 5.在国内首次成功克隆并测定了中国泡桐丛枝病原 16SrDNA基因序列,经同源性比 g 较,表明属于植原体 16Srlo中的一个新株系。其测序的 165 rDNA序列片段己被 Genebank Z 收录,其登录号为AY192577。 16.梨衰退病是我国一种重要的世界性对外检疫性病害,该病在我国还没有报道。本 Z 试验在国内首次引进了梨衰退病植原体总核酸,并在国内首次克隆并测定了其 16SrDNA g 基因序列,经同源性比较,与GeneBank中梨衰退病植原体序列同源性达99.72%。 g7.分别建立了植原体分类鉴定和检测、柑桔黄龙病病原检测、水稻白叶枯病菌与水 g 稻细菌性条斑病菌检测鉴定区分的实时荧光PCR方法。国内外未见同类报道。试验结果表 g 明,所有探针均只能特异性检测到目标病原菌;整个检测过程只需二小时;灵敏度比普通 PCR电泳检测高 100倍;其检测的绝对灵敏度为 30上3fg质粒 DNA,相当于 1个细菌细胞 g 的基因,相对灵敏度为 10’CFUed个细菌细胞。操作简单,整个检测过程实行自动化控制, Z 完全闭管,消除了PCR假阳性的污染,无须PCR后处理。 gs.对所建立的植原体实时荧光PCR反应体系和反应条件进行筛选优化,获得最佳反 4 应体系。为开发研制成实时荧光PCR试剂盒及检测方法标准化奠定了基础。 gg.建立了植物组织中提取病原菌模板DNA的方法(TAB微量快速抽提法,此法只需 Z 要0.2刁.3g植物样品,带菌种子的浸泡液即可直接检测到病原菌。较好地解决了从植物组 g 织中提取纯化病原微生物DNA的问题,为今后的应用特别是在难养菌、不能培养菌上的 g 应用创造了条件。


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