辣椒抗疫病相关基因的分析及QTL定位

【摘要】： 辣椒疫病，是辣椒上的一种毁灭性病害，除了引起大面积死秧外，还可造成叶片枯萎、果实腐烂、茎杆出现坏死斑等多种症状，成为影响我国辣椒生产的主要障碍。由于辣椒疫病的病原菌能在土壤中长期存活，并且适宜于辣椒生长的温湿度也非常适合于疫霉菌的生长和繁殖，因此辣椒疫病常暴发流行。另外辣椒疫病的病原菌易发生变异，导致耐(抗)药菌株的产生，药剂防治的效果也不理想，对辣椒疫病的防治措施中最重要的一项工作就是选育抗病品种。多数学者认为辣椒对疫病没有免疫品种，对疫病的抗性遗传规律也相当复杂，是由多基因所控制的数量性状。因此，抗疫病相关基因的标记、定位，是辣椒分子标记辅助选育抗病品种的关键步骤。 本研究以国内的抗疫病品种93-100-17-1-0和感疫病品种茄门为主要研究材料，以分析辣椒抗疫病相关基因为主线，通过抗病基因保守区域设计简并引物进行PCR、mRNA差异显示技术，以及利用AFLP分子标记技术构建分子连锁图谱，从组成型、诱导型和QTL定位等多角度研究辣椒抗疫病的相关基因，获得如下主要结果： 1．根据比较离体叶片接种法、切茎接种法、游动孢子灌根接种法，这3种接种方法在93-100-17-1-0、93-100-1-1、perennial、SCM334、茄门、伏地尖椒、灯笼椒、Yolo Wonder等8个辣椒品种(品系)上的抗病性反应，发现这3种接种方法均可用于辣椒品种抗疫病性状的鉴定，可以根据需要选择适宜的接种方法，并且93-100-17-1-0的抗病性最强，93-100-1-1、perennial、SCM334为高抗品种，灯笼椒为中抗品种，茄门、伏地尖椒、Yolo Wonder则为感病品种。 2．以抗病基因的保守区域为基础设计简并引物，对93-100-17-1-0、93-100-1-1、perennial、SCM334、茄门、伏地尖椒、灯笼椒、Yolo Wonder、CV98等9个辣椒品种(品系)的基因组DNA进行PCR扩增，分析辣椒组成型抗疫病相关基因。经测序分析，发现有5个抗病基因同源序列(RGA)的序列(B41、B43、B54、B61、B93)的最长ORF编码150个氨基酸以上，只有4个序列(B513、B64、C22、C36)的最长ORF编码80个氨基酸以下，其余序列的最长ORF编码的氨基酸介于80～150个之间。将所有的序列发送到GenBank，均被收录，基因库登记号为AY125911、AF492473、AF513548、AF513549、AF525124—AF525153。所得扩增片段的核苷酸序 列经BLAST分析，发现引物B和引物C所扩增的片段大多数与植物的抗 病性状有关，且与番茄、马铃薯、烟草的抗病基因或抗病基因同源序列有 较高的一致性。 3．一端用锚定弓物OligO（dT）15A、OligO（dT）15C、OligO（dT）15G，另一端用根据 已克隆的植物抗病基因的保守区域设计而成的简并引物B；、C；、D；，用 mRNA差异显示技术，分析诱导型辣椒抗疫病相关基因的表达。得到了两 个有差异表达的片段Oligo（d ）15CDI 和Oligo（d ）15ADI。经BLAST分析， 在基因库中找到了OligON 片段有较高的同源性的一个番茄的BAC 克隆，该克隆为番茄的一个表达序列标签。 4．以我国种质资源抗病品种 93八 0017八0、感病品种茄门的杂交后代建立了 国内第一个用于分析辣椒抗疫病相关基因的FZ群体，通过遗传分析和卡 方检验，证实杂交后代的抗疫病性状并不符合3：l 的分离规律，表明 931 刁 八心的抗疫病性状是由寡基因或多基因所控制的。采用 AFLP分 子标记，构建了一个含 46个标记位点J 个连锁群、覆盖长度为 13 sl石。M、 每个标记间的平均距离是 3 0刀cM的国内第二张辣椒分子连锁图谱。并在 此基础上，得到多个与辣椒抗疫病性状相关的QTL位点，将这些位点定 位在第1、第2、第5、第7、第8条连锁群上。这些位点均能解释表型变 异率达64％以上。其中最有意义的是位于第5条连锁群上128～132。M间 的QTL位点，从感受性、诱导稳定性这3个方面进行QTL分析均能证实 该位点的存在，区间约为4cM，且能解释表型变异率68％左右。