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芜菁花叶病毒CDN1株系植物表达载体构建和芜菁花叶病毒CHN5株系cDNA克隆

郑文光  
【摘要】: 芜菁花叶病毒是十字花科作物上的一种重要病原物。本文在分析芜菁花叶病毒NIa蛋白酶在多聚蛋白上识别位点基础上,设计了新的编码NIa蛋白酶识别位点的序列。同时根据芜菁花叶病毒各株系基因组保守的非限制性内切酶识别位点,设计出多克隆位点序列。在此基础上,将含有多克隆位点和编码NIa蛋白酶识别位点的Adaptor通过PCR介导插入到芜菁花叶病毒CDN1株系全长cDNA的NIb与CP区之间的NIa蛋白酶识别位点之后,将芜菁花叶病毒CDN1株系全长cDNA侵染性克隆pVIR95T改造成一个可利用的基因插入型表达载体pVIR95TM。利用DNA合成和PCR的方法得到人α-降钙素基因相关肽的编码序列DNA,将这段DNA插入到pVIR95TM载体的多克隆位点中,构建成在病毒寄主植物中表达人降钙素基因相关肽的表达载体pVIR95TCa。 根据芜菁花叶病毒各株系保守序列,设计引物,利用免疫捕获RT-PCR的方法获得芜菁花叶病毒CHN5株系覆盖其全长基因组94%的长约9.4Kb的DNA片段,并克隆到T-载体中去。用芜菁花叶病毒CHN5株系cDNA中长8.45Kb的DNA片段,替换pVIR95TM中CDN1株系cDNA的相应部分,构建芜菁花叶病毒CHN5株系的侵染性克隆载体pVIRCHN5。


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