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《湖南农业大学》 2003年
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没食子酸烷基酯的酶法合成及应用研究

王征  
【摘要】:没食子酸烷基酯(alkyl gallate)是没食子酸的重要衍生物。具有优良的抗氧化性能和抗菌能力。在食品、医药、化妆品、饲料工业中有着重要的用途。 目前,生产没食子酸烷基酯的方法仍采用化学合成法。产品单一,转化率低,能源消耗大,环境污染严重,资源浪费。生物催化和合成是未来工业发展方向,是人类经济活动与自然界建立和谐关系的必经之路。 本课题在单宁酶菌种选育及单宁酶制备研究的基础上,首次以反胶束体系为介质,确立了有机相中单宁酶活力测定方法,研究了单宁酶在反胶束中增溶定位方式、催化动力学和催化特性。建立了合成系列没食子酸烷基酯的反胶束催化体系和微乳凝胶反应体系,同时,探讨了反胶束体系中各种因素对不同生产体系中单宁酶催化活力的影响和微乳凝胶固定化酶催化体系中水的调控技术。最后,研究和比较了没食子酸烷基酯的抗菌能力和抗氧化性能。全文实验结果如下: 1 单宁酶菌种的选育和单宁酶的制备 以一株产单宁酶的黑曲霉为出发菌株,进行了菌株的诱变选育,得到了一株单宁酶高产菌株。它的酶活力将近是出发菌株的2倍。其产酶发酵条件为接种量:2.5ml/50mL,摇床150r/min,28℃,培养基组成:豆饼粉3%单宁2.5%K_2HO_40.2%KH_2O_40.2%MgSO_4.7H_2O 0.05%NaCl 0.05%。 通过40%-80%硫酸铵沉淀,透析,DEAE-纤维素阴离子交换层析和Sephadex G~150层析,得到电泳纯的单宁酶,SDS-凝胶电泳分析,该单宁酶有两种亚基,相对分子质量分别为7.59×10~4,6.03×10~4。硫酸酚法在485nm波长下测其吸收值,以葡萄糖作标准曲线,求得相应的糖含量为12.3%。 该酶最适pH为5,在pH4.0~7.0范围内均表现出较强的酶活性。在40℃时酶活力最大,在25℃~50℃都表现出较高的酶活力。 2 反胶束单宁酶的动力学性质研究 2.1 建立了HPLC同时测定反胶束酶催化体系中底物没食子酸和产物没食子酸烷基酯含量的方法。色谱条件为:Lichrospher C_(18)柱(250mm×4.6mm);流动相:70%A(80%甲醇):30%B(5mL醋酸/1000mL水);柱温:40℃;检测波长:274nm;进样量:20μL。用此方法可以测定反胶束反应体系中单宁酶的活力。 2.2单宁酶的紫外吸收光谱与荧光光谱说明反胶束体系中单宁酶的构象与其 在水相中的构象存在有明显的差异。单宁酶极有可能是以嵌入反胶束表面活性剂 界面或吸附在反胶束内壁的形式增溶的。 2.3建立了合成六种没食子酸烷基酷的反胶束体系,反胶束的组成是:AOT/异 辛烷/柠檬酸缓冲液。可分别合成没食子酸丙酷、没食子酸异丙酷、没食子酸丁 醋、没食子酸异丁酷、没食子酸戊酷和没食子酸异戊醋。 2.4不同的脂肪醇存在下,测出各反应体系的动力学参数不同,根据动力学参 数可得出以下结果:反胶束中单宁酶催化没食子酸醋化的动力学符合米氏方程; 反胶束单宁酶对已一C。脂肪醇专一性不强;单宁酶催化直链脂肪醇酷化的效率比 其催化支链脂肪醇醋化的效率高;C。脂肪醇存在下,单宁酶对没食子酸的亲合力 最强,催化效率最高。紫外吸收图谱说明不同脂肪醇对单宁酶的构象影响有差别。 2.5比较反胶束体系中单宁酶的稳定性和水相游离酶的稳定性试验结果说明: 反胶束体系有利于单宁酶的稳定。 没食子酸烷基醋的生物合成 .1对不同有机溶剂的选择研究中,异辛烷因非极性大,对酶活性影响小,是最 适合的有机溶剂。有机溶剂与酶活性的关系基本符合Laan实验规律。 3.2合成没食子酸丙酷、没食子酸丁醋和没食子酸戊酷的反胶束体系中,w0、 反应温度、pH、AOT浓度对单宁酶活性影响不同: 对于合成没食子酸丙酷体系,最适的反应条件是: W。=15:T=300C:pH=6:「AOT〕== 0.lmol/L 72h到达反应平衡,没食子酸转化率为87.4%。 对于合成没食子酸丁酷体系,最适的反应条件是: W0二15;T=40℃;pH=6;〔AOT」=0.Zmol/L 48h到达反应平衡,没食子酸转化率为90.3%。 对于合成没食子酸戊酷体系,最适的反应条件是: W。=12.5;T=45oC:pH=6;[AOT卜0.Zmol/L 72h到达反应平衡,没食子酸转化率为92.5%。 3.3建立的微乳凝胶固定化单宁酶催化系统可催化没食子酸与不同脂肪醇进行 醋化。NaZSO4/N aZSO4.IOH20盐水合对可有效调控有机相固定化酶催化系统中水 的活度。其调控能力与盐水合对的总量有关。 3.4在反应系统中加入盐/盐水合物对(NaZS认/N aZs仇.10H:0)可以明显提高没 食子酸的转化率。当PH值为6,温度为28℃,振摇速度为15Or/min时,在生产 PG、BG的MBGs反应系统中,加入总量1 .89,比例为1:z的Na:504/NaZSO4.IOHZO, 没食子酸的转化率可分别达到78.2%和85%,比对照分别提高82.2%、88.9%;在 生产AG的MBGS反应系统中,加入总量2.49,比例为l:z的NaZSO4/NaZSO4.IOHZO, 没食子酸的转化率为72.4%。比对照提高80.4%。经纯化和精制,没食子酸丙醋、 没食子酸丁醋和没食子酸戊酷的最终产率分别为:73.1%、SO.sryo、67.5w0。产量 分别为18.29/L;21.29/L; 19.39/L。 4没食子酸抗菌抗氧化性能研究 4.1抗菌实验研究表明:没食子酸烷基醋对沙门氏菌、酿酒酵母均
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ922

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