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《湖南农业大学》 2003年
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转JERFs基因提高辣椒抗病性的研究

杨国顺  
【摘要】:辣椒是一种重要的蔬菜作物和调味品。但由于各种病害的危害,辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直是十分重要的研究课题。通过常规育种手段从现有资源中选育出多抗、高抗、优质、高产品种难度大,耗时长。伴随病原菌的侵染,病程相关蛋白基因的表达是植物产生抗病反应的标志。通过抗微生物蛋白(如病程相关蛋白)的超表达是提高作物抗病性能的策略之一,然而,单个PR基因的表达仅能导致对几种真菌病害抗性的部份增加。在系统获得抗性中,许多病程相关基因的协同表达,从而有效地提高植物的广谱性抗病性。所以应用基因工程技术提高植物抗病性的一种更加有效的方法是使许多PR基因协同性的表达。就目前的技术而言,同时导入多个基因于一个植株中有较大的困难,因此导入控制抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面改良作物抗逆性提供一种全新的途径。植物基因工程的发展与完善,为作物的遗传改良提供了新的策略和强有力的工具,转基因技术已在200多种植物中获得成功。辣椒基因工程经过近10年的研究,已取得了一些成就,但进展缓慢,离体再生困难和遗传转化率太低是限制其发展的两大因素。为突破上述瓶颈,本研究以中椒5号甜椒和湘研10号辣椒为试材,分别就6-BA与IAA的不同浓度及组合、PA以及ABA对子叶离体再生的影响进行了较为系统的研究,建立了辣椒子叶高效植株再生体系。在此基础之上,利用GFP作为报告基因,研究农杆菌转化过程中工程菌液的pH值、共培养基中AS的浓度、共培时的温度与共培时间对转化效率的影响,建立了稳定有效的遗传转化体系。 应用上述试验体系,本研究成功地将从番茄cDNA表达文库中分离出的编码ERF型转录因子的新基因JERF10、JERF26、JERF33、JERF36(统称JERFs)导入中椒5号甜椒和湘研10号辣椒外植体(离体子叶)中,经Km筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交检测,获得了抗病性明显增强的转基因植株。在未实施任何胁迫的情况下,JERF33超表达的转基因植株中可见PR蛋白基因组成型表达。 本试验获得主要结果如下: 1.不定芽分化伸长期添加100 μ mol/L的PA、不定芽分化期添加0.3mg/L的ABA能显 著提高不定芽的伸长率。建立了辣椒子叶高效离体再生体系,子叶不定芽高效分化 培养基:MB+6一BA3.5~5.omg/L+IAAO.5~1.omg/L+PA(Spd,Spm)75~100 p mol/L+ ABAO.3mg/L+A gN035.omg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%;不定芽高效伸长培养基:MB+6一BAO.9 mg/L+IAAO.3mg/L+GA31.omg/L+PA100pmol/L+蔗糖3%+琼脂0.7%。 2.当工程菌液的pH值为5.2时,共培养基中添加200 p MAS,在23℃的黑暗条件下 共培sd,能较明显地提高辣椒的转化效率。 3.应用农杆菌介导法将‘肠舒污基因导入辣椒中,对经Km筛选的植株进行PcR检测, 其阳性率为8.1%~10.7%;对经PCR检测的阳性植株,进行PCR一Southern杂交检 测,所检测样品的阳性率为100%;进一步进行基因组DNA点杂交,阳性率为72.2%~ 77.8%;对经基因组DNA点杂交检测的阳性植株,随机抽取转刀尸侧留-刀沈月0 与川泊松二刀沈尺扮基因的各8株植株进行Northern杂交检测,了石砰了口、刀涌心J基 因的表达率分别为75%、87.5%。 4.获得了对黄瓜花叶病毒、辣椒疫病与辣椒疮痴病抗性明显增强的转基因辣椒新种 质,并进一步证实在转基因辣椒中,未经任何胁迫的条件下,pROKZ一刀汲心J基因 的超表达能诱导碱性一p一葡聚糖昔酶、碱性几丁质酶、渗调蛋白、蛋白酶抑制剂、 具RNA酶活性的蛋白与防御素等PR蛋白基因的组成型表达。这些研究结果表明: .左泥尺U在转基因辣椒中的异源表达能增强植株对病毒、细菌和真菌的抗性。从这 些研究结果可推测:在经济作物中利用转录调控蛋白基因可能增加其广谱性的抗病 力。
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