禾长蠕孢菌用于稗草生防综合评价及功能改造研究

【摘要】：目前国内微生物除草剂的研究多集中在病原菌的分离和初步筛选，或对生防潜力菌的某一方面进行过研究、报道。本研究对稗草生防潜力菌禾长蠕孢稗草专化型(Helminthosporium gramineum Rabenh f.sp．echinochloae，HGE)从病原菌形态学、生物学特性、流行病学、寄主范围、毒素、致病机理、培养基筛选、大规模生产孢子的技术和方法、微生物除草剂剂型及应用等方面进行了全面综合评价。并用物理、化学和生物技术相结合的方法对HGE菌进行了初步改良。为利用禾长蠕孢菌稗草专化型(HGE)开发微生物除草剂打下了良好的基础。研究获得了以下结论： 1、从近百个稗草病原菌中筛选出4个特色病原菌：链格孢菌(Alternaria alternata，简写为AA，下同)，弯孢菌(Curvularia lunata，CL)。禾长蠕孢菌稗草专化型(HGE)和尖角突脐孢菌(Exserohilum monoceras，EM)。从形态学、生物学特性和寄主范围等比较研究后，选择HGE菌作为稗草生防潜力菌。HGE菌属丝孢纲(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)禾长蠕孢属(Helminthosporium)。 2、HGE菌菌落生长紧密，黑色至黑褐色，气生菌丝少；孢子棕黄色至褐色，呈圆柱状或椭圆形，两端钝圆，大小17.0～21.3×62.5～102.5μm，孢子有隔，一般为2～6个隔。产孢量介于CL和EM之间。该菌能在10％稗汁葡萄糖培养液(Barnyardgrass decoction dextrose liquid，BDDL)和改良费氏(Fries)培养液(MFL)中发酵培养产生大量菌丝体。 3、温度、光照、pH值和通气等对HGE菌的生长、产孢有明显的影响。28℃、黑暗、pH值中性偏微酸(6.0-6.5)和通气(空气充足)条件下最有利于HGE菌的生长和产孢。HGE菌对高温敏感，温度在30℃以上时生长和产孢受到明显抑制。HGE菌对无芒稗(Echinochloa crusgalli(L.)Beauv．Var．mitis(Pursh)Peterm；英文Beardless Barnyardgrass)、光头稗(E．colonum(L．)Link；英文Junglerice)、硬稃稗(台湾稗)(E.glabrescens Munro ex Hook．F．；英文Taiwan Barnyardgrass)高度致病、对稗(稗子)(E.crusgalli(L．)Beauv；英文Barnyardgrass)致病力稍差。除对高梁、大麦轻度感染外，HGE菌对参测的禾本科、豆科、十字花科等十多种作物安全。 4、HGE菌对稗草的致病性较高，但其流行病学条件要求也较高。以2.5、107抱子/MZ以上 浓度的HGE菌喷雾接种，接种后保持25一28℃、RH95%以_L、12一18小时黑暗的环 境条件，HGE菌对1 .5一2.0叶期的稗草秧苗的株感病率、株死亡率均可达85%以上， 干重防效达75%以上。HGE菌对1 .0一5 .0叶期的稗苗的感病株率达80%以上，对1 .0一3.0 叶期株死亡率85%以上，干重防效最高的是3.0叶期，达83%以上。 5、HGE菌在PDA培养基上产生黑色毒素、在改良Fries(IFL)和稗汁葡萄糖培养液中震荡 发酵培养均能产生寄主专化性毒素。毒素对稗草具有明显的抑制作用，对水稻无毒。 毒素与抱子混用，或先喷毒素后喷抱子液对稗草的致病性强于单独喷雾抱子或毒素。 发酵滤液经浓缩、萃取获得粗毒素，粗毒素稀释200倍对稗草具有较强的毒性。粗毒 素经紫外光谱分析，有4个吸收峰值，与小麦根腐长蠕饱菌毒素相似，推测为菇类化 合物。其成分和化学结构有待进一步研究、分析。 6、HGE菌对稗草的致病机理:HGE菌饱子液喷雾接种后，一首先通过饱子分泌毒素使稗草 叶片产生斑点，致使稗植株长势减弱，抗性下降;同时抱子从两端细胞萌发产生芽管， 芽管穿过叶片表皮细胞进入叶肉组织，继续繁殖、侵染，导致叶片病斑扩大、枯死， 最终导致感病植株枯死。 7、HGE菌在液体培养基中发酵培养可产生大量菌丝体。粉碎菌丝体进行诱导培养，可使 菌丝体产生饱子，但抱子量不多。用HGE菌的菌丝体、PDA菌块及其抱子悬液作为 接种体，接种到固体培养基上，进行固体发酵培养，可大量生产HGE菌抱子，袍子产 量随接种体量、浓度的增加而提高。以抱子悬液作接种体时抱子产量最高。 8、从十多种廉价、易得的农业基砒}物质中筛选出以稗草植株为主要基质的HGE菌固体发 酵培养基。添加少量化合物并优化参数后，HGE菌在稗草基质培养基上平均每克干物 质产饱量为6.79、10“个抱子，最大产袍量达到7.97只1护/克干物质。产抱量比国外同类 研究提高了近3倍，该技术已申报国家发明专利。 9、用亚硝基肌困TG)诱变HGE菌，获得诱变菌株玩2，其抱子产量比原始菌株(HGE) 提高犯.60，0。再以x26:为出发菌株，用“oe。:射线6500y剂量辐照57min，有7.750，0的 菌株产抱量高于出发菌株，其中代号为Fn，21、Fll.16和FH!;o的辐照菌株的产抱量分 别比 126:提高54.4%、51 .5%和41 .7%。化学和物理技术相结合处理稗草生防潜力菌， 获得的突变菌株产抱量比原始菌株提高1倍以_}_几。但高产抱突变菌株对稗草的致病性、 防效与原始菌株相比无明显增强。 10、以Cl和IIGF菌做亲木菌株，试图通过原‘}二质体融合技术将CI菌生长快、产饱能力 强与HGE菌对稗草致病性强、对作物安全的优良特性结合在一起，以期获得生长快、 产袍多、对稗草致病性强、对作物安全的新型工程菌株。已掌握了2菌原