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鸡生长轴基因的SNPs分析及cGHR基因第八、九内含子的克隆测序研究

欧阳建华  
【摘要】:鸡生长轴各基因主要调控肌肉、骨骼的生长、脂肪沉积及饲料报酬大小等整个机体的生长发育。下丘脑根据机体需要分泌生长激素释放激素和生长抑素,双重作用于垂体以控制生长激素(GH)的分泌;GH经血液循环至肝脏,与细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合,启动细胞内的信号传导机制,促进胰岛素样生长因子(IGFs)的表达;IGFs再通过血液循环到达机体的局部组织,促进组织细胞的生长和分化。本试验选择GH、GHR及IGF-1三个基因作为研究目标,对GH基因内含子1的一个Msp Ⅰ位点、IGF-1基因5′调控区中的一个Pst Ⅰ位点及GHR基因内含子2的一个Hind Ⅲ位点建立了PCR-RFLP体系,检测了8个鸡种(含两个外来鸡种和6个地方鸡种)这三个位点的遗传多样性,并分析了该三个位点对宁都三黄鸡、万载康乐黄鸡及泰和乌骨鸡部分生产性能的影响。 较多的研究发现,GHR基因的变异是导致性连锁(SLD)矮小鸡的遗传基础,不同的SLD鸡群的矮小表型是由生长激素受体基因的不同突变造成的,结构变异、编码区的突变、剪切位点的突变、缺失突变甚至调控区的突变都可能导致矮小鸡的产生,而且不同的等位基因对鸡矮小表型的影响存在量上的差异。该基因的突变既使不导致矮小鸡的产生,也会对生产性能产生较大的影响。介于GHR基因的重要作用,本试验采用DHPLC及直接测序法筛选cGHR基因的SNPs,并对筛选得到的部分SNPs进行开发,将其中的一个SNP在全国24个家禽品种中进行遗传多样性检测,而将另外一个SNP在全同胞参考家系中进行基因型检测,分析该位点与鸡主要生产性状的关联。 目前,鸡GHR基因的内含子仅知道1个内含子5序列,为了完善GHR基因的结构,本试验还对GHR基因的内含子8、9进行了克隆测序,以求获得这两个未知内含子序列。 现将试验结果总结如下: 1.本次试验在随机群体中分析了cGH基因、cIGF-1基因与生产性状的关联,运用参考家系分析了新发现的一个突变与生产性状的关联,试验均发现同一基因座对生产性能的影响在不同品种、不同交配类型及不同性别中体现不一。 2.通过DHPLC及直接测序法对cGHR基因外显子10及3′UTR区共计约2500bp的序列上寻找SNPs,在3′UTR区发现9个SNPs,其中酶切位点的突变为4个。在外显子10中发现6个SNPs,其中酶切位点的突变为3个,且有3个突变导致了氨基酸的改变,即cGHRmRNA and 3′UTR序列中1507位G→T的突变导致外显子10中203位氨基酸改变(Ser→Thr)、1512位A→T的突变导致外显子10中205位氨基酸改变(Thr→Ser)、1598位G→C的突变导致外显子10中234位氨基酸改变(Glu→Gln),这些改变会导致cGHR蛋白质二级结构和理化特性的改变。 3.在cGHRmRNA and 3′UTR序列中2907位存在C→A的突变,这一突变导致限制性内切酶BSURI(GGCC)的消失,定义A基因为无酶切位点(945 bp),B基因为有酶切位点(458bp和487bp),其基因型在矮脚鸡和正常鸡中表现出了明显的不同,矮脚鸡中AA型高达93% 湖南农业大学博士学位论文 鸡生长轴基因的SNPs分析及cGHR荃因第八、九内含子的克隆测序研究 从型高达93%(28个),AB型为7%(2个),无BB型,而其它鸡从型仅为O一3个,绝大 多数为BB型,可以认为这是与矮脚有关的一个新的突变位点。 4.选用来航鸡作为试验材料,通过克隆测序,获得cGHR基因内含子8及9的全部序列, 并己成功登录GenBank,登录号分别为:内含子s为AY481574,内含子9为AY327492。使 cGHR基因由仅仅知道一个内含子5序列,扩大到知道3个内含子序列。 5.分析cGH基因内含子1 PCR一RFLP一人仰I位点时发现,地方鸡种均以A等位基因为主, 而外来鸡种均以C等位基因为主,二者差异较大,产生这种基因频率的差异主要是因为血 缘关系而非C等位基因具有较高的生产性能;。IG卜l基因PCR一RFLPee子毖tl位点A等位基 因频率在大多数鸡种中相对较高,但在生长速度较快的罗曼父母代父系、肉用型品种隐性 白羽鸡及地方鸡种余干五黑鸡的B等位基因频率大大高于A等位基因的频率,表明生长速 度较快的品种B等位基因频率有较高的趋势;GHR基因内含子2的PCR一RFLP一Hz’刀dm位点 的基因频率在所有检测鸡种中均以C等位基因占绝对优势,C等位基因频率最低的也有 0.85,最高达1 .0,在所研究的鸡种中除来航鸡外,其它鸡种该位点遗传多样性均很差, 试验也发现该位点遗传多样性是否丰富,不以蛋用或肉用而定,而是因品种而异。 6.分析eGH基因内含子1 pCR一RFLp一似劝I位点和eIGF一1基因pCR一RFLpsepstl位点与体 重的关系发现,对于宁都三黄鸡的初生重、1月龄、2月龄、3月龄及4月龄体重,GH基 因该座位对公鸡无显著影响,而对母鸡1月龄体重影响差异极显著(CC基因型最大),其 它各阶段影响差异不显著。分析IGF一1基因型与宁都三黄鸡体重之间的相关性发现,差异 均不显著;在万载康乐黄鸡中,GH基因该位点对8周龄体重表现为差异不显著,而在12周 龄和18周龄时表现为差异极显著(AB型体重最大),显示出该位点对其后期生长影响较大, IGF一1基因在万载康乐黄鸡中呈现出一定的杂合优势,且在12周龄表现为显著差异,因此 在对万载康乐黄鸡体重进行选种时可选择从型与BB型交配。 7.在分析GH基因对鸡产蛋性能的影响时


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