虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立与白藜芦醇的生物合成、调控及生物转化研究
【摘要】:虎杖(Polygonum cuspidatum Sie bet Zucc)为蓼科蓼属草质状亚灌木。广泛分布于辽宁、陕西、甘肃、四川、贵州、云南及华东、中南等省区,是我国传统的中草药,现代药学研究证明虎杖具有多种药理作用。虎杖中的有效成分之一的白藜芦醇(Resveratrol,略写为Resv)具有许多功能作用,主要表现在抗癌作用、抗心血管疾病、平衡女性雌激素等三个方面,受到药学界广泛重视,具有重要的研究和开发价值。随着对虎杖次生代谢产物及其活性成分的深入研究,发现在众多植物中虎杖白藜芦醇的含量最高。本文以虎杖特别是其根状茎芽为外植体诱导愈伤组织,并对颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立及其白藜芦醇的生物合成、调控与生物转化、白藜芦醇含量差异等方面进行了较全面而系统地研究。研究结果如下:
1.种质资源研究
对武陵山区不同地域、同一地方采集的虎杖植株进行白藜芦醇含量比较测定,结果表明:白藜芦醇含量有较大的差异。通过对30个不同地区、不同地理条件的虎杖生长环境调查,发现最佳生长条件为:坡向南坡、坡位上坡,土壤种类黄棕壤,土壤质地粘土,土壤母质板页岩,郁蔽度有零星光照。虎杖白藜芦醇含量最高的时期为8~9月。白藜芦醇主要集中在根状茎中,其他部位很少;根状茎芽的含量异常丰富,是组织培养诱导愈伤组织并建立愈伤组织悬浮培养首选的外植体。
2.植物组织化学定位与定量研究
植物组织化学定位与定量:建立了一套虎杖白藜芦醇组织化学定位和检测的方法。特别是为建立颗粒愈伤组织悬浮培养体系提供理论和技术支持平台。通过染色后的明场显微镜观察以及AlCl_3处理、水处理后荧光显微观察等方法研究,结果表明:虎杖白藜芦醇主要分布在纤维化程度高的维管组织,即韧皮部的韧皮纤维,木质部导管、木纤维细胞,以及周皮木栓层细胞。悬浮颗粒愈伤组织白藜芦醇主要积累在减慢期;白藜芦醇大量分布在愈伤组织周皮及维管组织节结上,
【关键词】:虎杖 白藜芦醇 组织化学定位 内源激素 颗粒愈伤组织悬浮培养 生物反应器 无机元素 生物转化
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S567.196
【目录】:
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S567.196
【目录】:
- 第一章 概论18-29
- 1 立题的目的与意义18
- 2 白藜芦醇的国内外研究现状、水平和发展趋势18-29
- 2.1 白藜芦醇的结构、植物中的分布、药理作用18-22
- 2.1.1 白藜芦醇的结构19
- 2.1.2 白藜芦醇在植物中的分布19
- 2.1.3 药理作用19-22
- 2.2 植物药用活性成分在不同组织部位的含量及其在组织细胞中的定位研究22-23
- 2.3 矿质营养、植物内源激素的变化对植物药用活性物质形成的影响23
- 2.4 植物细胞培养生产次生代谢物质研究进展23-25
- 2.5 微生物转化研究25-26
- 2.6 白藜芦醇生物合成研究26-29
- 第二章 虎杖白藜芦醇组织化学定位、含量检测及高含量资源的筛选29-43
- 1 材料与方法29-31
- 1.1 材料29
- 1.2 方法29-31
- 1.2.1 不同地区虎杖白藜芦醇的提取29
- 1.2.2 虎杖不同组织部位白藜芦醇的提取29-30
- 1.2.3 高效液相色谱法测定白藜芦醇的含量30
- 1.2.4 制片条件的选择与制片方法30
- 1.2.5 荧光显微观察30
- 1.2.6 荧光分光光度计检测切片中白藜芦醇的含量30-31
- 2 结果与分析31-38
- 2.1 HPLC测定白藜芦醇标样及虎杖样品中白藜芦醇31
- 2.2 虎杖中各组织部位的白藜芦醇含量测定31-32
- 2.3 不同采集月份的虎杖鲜根状茎中白藜芦醇含量变化32
- 2.4 虎杖鲜根茎与鲜根茎芽、干根茎粉中白藜芦醇含量的比较32-33
- 2.5 不同地理条件对虎杖白藜芦醇的含量33-35
- 2.6 显微镜观察结果35-37
- 2.6.1 明场显微观察35
- 2.6.2 荧光显微观察35-37
- 2.7 HPLC检测根茎中组织部位的白藜芦醇含量37
- 2.8 荧光分光光度计检测虎杖根茎中白藜芦醇37-38
- 3.讨论38-43
- 第三章 影响虎杖根状茎白藜芦醇含量的因素探讨43-63
- 1 材料与方法43-45
- 1.1 材料43-44
- 1.2 方法44-45
- 1.2.1 虎杖白藜芦醇的高效液相测定44
- 1.2.2 虎杖根状茎中无机元素的分析44
- 1.2.3 气象因素44
- 1.2.4 植物激素检测波长的选择和分离条件44
- 1.2.5 内源激素的提取、纯化及测定44-45
- 1.2.6 标准溶液的配制45
- 1.2.7 相关分析与主成分分析方法45
- 2 结果与分析45-60
- 2.1 高效液相条件的确定45-48
- 2.1.1 波长的选定45-46
- 2.1.2 洗脱条件的选择46
- 2.1.3 梯度洗脱条件46-47
- 2.1.4 线性关系的测定47-48
- 2.2 内源激素对虎杖根状茎白藜芦醇含量的影响48-54
- 2.2.1 虎杖中各月份内源激素与白藜芦醇含量48-49
- 2.2.2 植物内源激素与白藜芦醇的含量变化分析49-50
- 2.2.3 内源激素与白藜芦醇含量的相对集中性和离散性50
- 2.2.4 内源激素与白藜芦醇含量的相关系数分析50-51
- 2.2.5 内源激素与白藜芦醇含量的主成分分析51-54
- 2.3 无机元素、气象因素对虎杖白藜芦醇含量变化的影响54-60
- 2.3.1 无机元素对虎杖白藜芦醇含量变化的影响54
- 2.3.2 虎杖根状茎中各月白藜芦醇的含量(HPLC法)与气象要素的统计54-56
- 2.3.3 各分析指标的相对集中性和离散性56-57
- 2.3.4 各分析指标的相关性分析57
- 2.3.5 无机元素、气象因素对虎杖白藜芦醇含量的主成分分析57-59
- 2.3.6 白藜芦醇量的动态变化与主成分的多元相关与回归分析59-60
- 3 讨论60-63
- 第四章 虎杖愈伤组织诱导及颗粒状愈伤组织悬浮培养体系的的建立63-80
- 1 材料与方法63-66
- 1.1 材料63
- 1.2 方法63-66
- 1.2.1 愈伤组织适宜培养基的筛选63-64
- 1.2.2 愈伤组织生长曲线64
- 1.2.3 愈伤组织白藜芦醇提取与测定64
- 1.2.4 愈伤组织白藜芦醇变化曲线的测定64-65
- 1.2.5 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养体系的建立65
- 1.2.6 虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养生长状态的观察与测定65-66
- 1.2.7 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养66
- 1.2.8 颗粒愈伤组织悬浮培养白藜芦醇的提取及含量测定66
- 2.结果与分析66-77
- 2.1 不同基本培养基上的诱导实验66-67
- 2.2 激素种类及水平的诱导比较实验67-68
- 2.3 虎杖根状茎和根状茎芽在不同激素水平培养基上的诱导效果比较68-69
- 2.4 虎杖茎和叶在不同培养基上的诱导实验69
- 2.5 不同材料诱导的愈伤组织中白藜芦醇含量的检测69
- 2.6虎杖根茎芽愈伤组织中高产白票芦醇细胞的筛选69-70
- 2.7 愈伤组织生长曲线及生长状况70-71
- 2.8 愈伤组织生长曲线中不同时期白藜芦醇的含量变化71-72
- 2.9 细胞悬浮培养生长的正交实验72-74
- 2.10 虎杖颗粒状愈伤组织悬浮培养过程中悬浮液各种理化因子的变化74-77
- 2.10.1 悬浮培养液中溶氧水平、pH、电导率、渗透压的变化74-76
- 2.10.2 虎杖悬浮细胞的生长和白藜芦醇的变化情况76-77
- 3.讨论77-80
- 第五章 2L气升式生物反应器悬浮扩大培养虎杖颗粒愈伤组织研究80-92
- 1、材料与方法80-83
- 1.1.材料80
- 1.2 方法80-83
- 1.2.1 生物反应器培养虎杖细胞80-81
- 1.2.2 虎杖悬浮细胞培养液各种生理指标的测定81
- 1.2.3 苯丙氨酸转氨酶活性测定81-82
- 1.2.4 过氧化物酶活力的测定82
- 1.2.5 总糖含量的测定82
- 1.2.6 蛋白质含量的测定82
- 1.2.7 胞内胞外白藜芦醇的提取与检测82-83
- 2.结果与分析83-90
- 2.1 细胞生长与细胞生长态势的关系83-90
- 2.1.1 培养液中糖利用动态83
- 2.1.2 培养液中pH值变化83-84
- 2.1.3 培养液中溶氧水平的变化84-85
- 2.1.4 培养液中渗透压的变化85
- 2.1.5 培养液中电导率的变化85-86
- 2.1.6 培养液中苯丙氨酸转氨酶(PAL)的活性86-87
- 2.1.7 培养液中过氧化物酶的活力与悬浮细胞生长的关系87
- 2.1.8 培养液中蛋白质含量的变化87-88
- 2.1.9 悬浮细胞生物量的变化88
- 2.1.10 胞内外白藜芦醇含量的变化88-90
- 2.1.11 不同大小细胞团中白藜芦醇及其类似物含量的区别90
- 3.讨论90-92
- 第六章 虎杖白藜芦醇的生物合成途径探讨92-105
- 1 材料与方法92-93
- 1.1 材料92
- 1.2 方法92-93
- 1.2.1 苯丙氨酸作为前体添加调控实验92-93
- 1.2.2 白藜芦醇类似物调控实验93
- 1.2.3 苯丙氨酸与白藜芦醇类似物添加调控中,培养液各种生理生化指标测定93
- 2 结果与分析93-102
- 2.1 苯丙氨酸(Phe)作为前体的研究93-98
- 2.1.1 Phe诱导子对虎杖悬浮细胞液pH和溶氧水平(DO)的影响93-94
- 2.1.2 Phe诱导子对悬浮培养体系电导率和渗透压的影响94-95
- 2.1.3 Phe诱导子对培养液POD和苯丙氨酸转氨酶(PAL)的影响95-96
- 2.1.4 Phe诱导子对悬浮培养液碳源浓度的影响96-97
- 2.1.5 Phe前体对虎杖悬浮细胞生长的影响97
- 2.1.6 苯丙氨酸诱导子对白藜芦醇的影响97-98
- 2.2 白藜芦醇类似物调控98-102
- 2.2.1 细胞生长量及培养液中pH值的变化98
- 2.2.2 培养液中溶氧水平和电导率的变化98-99
- 2.2.3 培养液渗透压和POD的变化99-100
- 2.2.4 培养液中碳源和PAL的变化100-101
- 2.2.5 白藜芦醇类似物及白藜芦醇的变化101-102
- 3 讨论102-105
- 第七章 诱导因子对虎杖白藜芦醇产生与积累的调控105-125
- 1 材料与方法105-106
- 1.1 材料105
- 1.1 方法105-106
- 1.2.1 无机元素的调控105
- 1.2.2 外源生长物质KT的调控105-106
- 1.2.3 微生物诱导因子的添加106
- 1.2.4 紫外照射诱变106
- 1.2.5 细胞生理态势指标的测定106
- 1.2.6 蛋白质含量的测定106
- 1.2.7 糖含量的测定106
- 1.2.8 过氧化物酶(POD)活性分析106
- 1.2.9 苯丙氨酸转氨酶活性的测定106
- 1.2.10 细胞内、外白藜芦醇的提取及含量的测定106
- 2 结果与分析106-122
- 2.1 无机元素的调控106-109
- 2.1.1 Mg~(2+)的影响107-108
- 2.1.2 Cu~(2+)的影响108-109
- 2.2 外源生长物质激动素(KT)的调控109-114
- 2.2.1.悬浮培养液中溶氧水平及电导率的变化109-111
- 2.2.2 悬浮培养液中渗透压和pH的变化111-112
- 2.2.3 悬浮培养液中过氧化物酶及糖变化112-113
- 2.2.4 悬浮细胞的生长和白藜芦醇积累113-114
- 2.3 微生物诱导因子的调控114-117
- 2.3.1 细胞培养液中pH及溶氧水平的变化114
- 2.3.2 细胞培养液中电导率和渗透压的变化114-115
- 2.3.3 细胞培养液中POD和蛋白质的变化115-116
- 2.3.4 细胞培养液中苯丙氨酸转氨酶(PAL)和碳源的变化116-117
- 2.3.5 微生物诱导因子对白藜芦醇的影响117
- 2.4 紫外照射诱变117-122
- 2.4.1 培养液中溶氧水平和电导率的变化117-118
- 2.4.2 培养液中渗透压和pH的变化118-119
- 2.4.3 培养液中蛋白质和糖的变化119-120
- 2.4.4 培养液中PAL和POD的变化120-121
- 2.4.5 紫外照射对悬浮细胞的生长和白藜芦醇积累的影响121-122
- 3 讨论122-125
- 3.1 无机元素调控影响122-123
- 3.2 外源生长物质激动素(KT)的调控123
- 3.3 微生物诱导的影响123
- 3.4 紫外诱变的影响123-125
- 第八章 利用生物转化技术提高虎杖中白藜芦醇的含量及其转化机理探讨125-136
- 1、材料与方法125-127
- 1.1 材料125-126
- 1.2 方法126-127
- 1.2.1 微生物诱导虎杖白藜芦醇前体物转化成白藜芦醇126
- 1.2.2 诱导虎杖白藜芦醇类似物生物转化为白藜芦醇的条件126
- 1.2.3 高效转化虎杖愈伤组织材料中白藜芦醇的研究126
- 1.2.4 白藜芦醇类似物的提取与分离126-127
- 1.2.5 白藜芦醇类似物结构鉴定127
- 2 结果分析127-134
- 2.1 虎杖白藜芦醇前体物的微生物转化127-128
- 2.2 微生物转化条件128-129
- 2.3 虎杖愈伤组织中白藜芦醇类似物的高效转化129-130
- 2.4 白藜芦醇类似物的提取、分离及结构鉴定130
- 2.5 白藜芦醇类似物的结构130-134
- 3 讨论134-136
- 缩略词表136-137
- 全文总结137-140
- 参考文献140-148
- 图版及图版说明148-164
- 致谢164-165
- 作者简介165-167
| 【引证文献】 | ||
|
|||||||||
|
|||||||||
|
|||
|
|||
|
|||||||||
|
|||||||||
|
|||||
|
|||||
| 【共引文献】 | ||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
| 【同被引文献】 | ||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
| 【二级引证文献】 | ||
|
|||||||||||||||
|
|||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||
| 【相似文献】 | ||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||



