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《湖南农业大学》 2005年
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三江源国家自然保护区土壤微生物的分子多样性研究

张于光  
【摘要】:土壤微生物是自然物质循环不可缺少的成员,担负着分解动植物残体的重要作用,直接关系到土壤养分的有效性,对植物生长起到重要的作用,同时微生物在土壤肥力评价和生物净化等方面也有着重要的作用。土壤微生物对环境变化很敏感,能够较早地指示生态系统功能的变化,对于退化生态系统的恢复和治理以及提高不同植被的生产力均有重要的理论和实践意义。 三江源自然保护区是青藏高原的主体部分,是黄河、长江和澜沧江的发源地,平均海拔4400m,孕育了世界上海拔最高、面积最大的高寒草甸和高原湿地。该地区原始自然状态保存较好,是气候、环境变化信息最敏感最完整的载体和自然环境演变过程最忠实的科学记录。由于全球气候变化和人为破坏,“三江源”的生态环境不断恶化,加强三江源地区的生态保护刻不容缓。研究三江源地区的土壤微生物,揭示三江源土壤微生物的生态分布和区域特异性,将为评价三江源地区的生态环境,了解三江源地区土壤微生物在全球变化中的影响,为三江源自然保护区保护策略的制定提供科学依据。 本研究主要通过PCR扩增、基因克隆、RFLP和序列分析对三江源自然保护区不同植被和海拔高度土壤环境中的固氮酶基因nifH、反硝化酶基因nirK与nosZ和16S rDNA的分子多样性进行了分析,同时探讨了不同植被和海拔高度土壤中固氮微生物、反硝化细菌等功能微生物的多样性及其主要影响因子。其主要结果如下: 1、用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法研究 土壤微生物分子生态学研究的关键技术之一是从各种环境样品中高效的获得可进行分子生物学研究的基因组DNA。本研究利用SDS高盐法、变性剂加SDS高盐法和溶菌酶加SDS法三种方案对土壤微生物总DNA进行了提取,然后通过电泳加树脂柱回收和连续2次树脂柱回收两种方法进行了纯化,结果表明,变性剂加SDS高盐法的DNA提取效率明显高于其它两种方法,电泳加树脂柱法的纯化效果更好。PCR扩增表明,经过两种纯化方法后得到的DNA,都可以进行16SrDNA扩增和nirK、nosZ、nifH等功能基因的扩增。因此,认为变性剂加SDS高盐法是一种更为高效、可靠和适合于环境微生物分子生态学研究的DNA提取方法。 2、三江源地区土壤固氮微生物的分子多样性研究 为了了解青藏高原地区土壤固氮微生物的群落结构及其差异,本研究首次利用PCR-RFLP和测序分析对位于青藏高原腹地的三江源自然保护区土壤微生物固氮基因(nifH)的多样性和系统发育进行了探讨。研究选取了来自于不同海拔高度、植被类型的6个样品,根据样地的生物地理化学性状的主成分分析(PCA)表明,6个样品可以聚类分为3个不同的组,其中样地YS-2、YS-3、ZD-1和ZD-2较明显的聚类在
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