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超级稻细胞凋亡机制的初步研究

唐婕  
【摘要】:本研究利用外源化学信号分子诱导细胞凋亡,探讨了植物细胞凋亡的机理。从超级稻中克隆了与细胞凋亡相关的DAD1基因,并使DAD1基因在大肠杆菌中得到了表达。 1.外源信号分子诱导细胞凋亡: a.采用超级稻不同继代次数的愈伤组织建立了不同悬浮细胞体系,比较不同悬浮细胞的生长状况,并探讨了悬浮细胞在培养过程中产生胞外POD活性的变化情况。结果表明:其愈伤组织分散性越好,愈伤组织的褐化程度越轻,越容易建立悬浮细胞系;随着愈伤组织继代次数的增加,悬浮细胞胞外POD活性和细胞悬浮度呈先上升后下降趋势。外源H_2O_2,CaCl_2与VK3诱导悬浮细胞所产生的胞外POD活性并不相同,相同浓度的VK3、CaCl_2和H_2O_2都抑制胞外POD活性,对继代六次的愈伤组织的悬浮细胞胞外POD活性影响最大,H_2O_2对POD的抑制作用更为强烈。H_2O_2随浓度和处理时间的增加,使胞外POD的活性减弱;处理6h、12h,胞外POD活性随着VK3和CaCl_2浓度的增加而增强,但处理48h胞外POD活性随浓度的增加而减弱。由此说明了VK3、CaCl_2和H_2O_2都抑制胞外POD活性,增强了胞内POD活性,诱导了细胞凋亡,H_2O_2的诱导作用最强。 b.利用台酚蓝染色和DNA琼脂糖凝胶电泳两种方法检测悬浮细胞凋亡的情况。利用3mmol/l的VK3、CaCl_2和H_2O_2处理悬浮细胞后,随着处理时间延长,其细胞死亡率增加,48h后其细胞死亡率由最初19.3%分别提高到73%、82%和91%,其中H_2O_2对悬浮细胞死亡率之影响最大;3mmol/l VK3、CaCl_2和H_O_2处理悬浮细胞12小时后,使悬浮细胞产生不同程度的DNA片段化,并且H_2O_2处理悬浮细胞产生DNA片段化最为强烈。由此可见,VK3、CaCl_2和H_2O_2都激活了细胞内的核酸内切酶,促进凋亡。 2.DAD1基因克隆与载体构建及表达 据报道,DAD1基因是与细胞凋亡相关的最为保守的一个基因,在动物中能够抑制细胞凋亡,但是在植物细胞中是否具有类似功能尚不确定。为了今后进一步探讨植物细胞凋亡的机理,本试验从超级稻中分离克隆DAD1基因,并使基因DAD1在大肠杆菌中得到了表达。


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