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《湖南农业大学》 2006年
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鲢(Hypophthalmichthys molitrix)IL-10基因的克隆及原核表达

肖凡书  
【摘要】:白细胞介素10(IL-10)是一种作用广泛的抗炎细胞因子,主要功能是限制和最终终止炎症反应。本研究采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)-PCR方法首次扩增出鲢IL-10的cDNA,其全长为1248bp,包含5′非编码区156bp,3′非编码区552bp,开放阅读框540bp。鲢IL-10的开放阅读框编码179个氨基酸,其中包含构成两对二硫键的四个保守半胱氨酸。以15种动物及病毒的IL-10氨基酸序列构建系统发育树,并进行了相应的探讨。RT(reverse transcriptase)-PCR结果显示鲢IL-10 mRNA主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达。 根据鲢IL-10的cDNA序列设计含有酶切位点的表达引物,将扩增的鲢IL-10完整开放阅读框和原核表达载体pET-32a-c(+)双酶切之后,连接、构建重组表达质粒,经测序无误后,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在分子量约39kD左右处有明显表达条带,与预期分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵体形式存在。变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔,获得兔多克隆抗鲢IL-10抗体,Western blot检测到兔多克隆抗鲢IL-10抗体可有效地与重组蛋白结合。这为进一步研究IL-10的功能奠定了基础。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S917.4

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【参考文献】
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