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《湖南农业大学》 2007年
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H5N1禽流感病毒HA和NA部分蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

姚艳  
【摘要】: 禽流感(avian influenza,AI)是A型流感病毒引起的禽类感染疾病综合征,其临床表现包括亚临床感染、中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降和严重的致死性疾病。由H5N1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)是近几年来在许多国家流行、给家禽养殖业带来巨大经济损失、而且威胁到人类的健康和安全的一种烈性传染病。AIV的快速检测技术是有效控制AI流行的检测手段和重要前提,为此我们进行了该研究。 本试验参照GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素(hemagglution HA)和神经氨酸酶(neuramindase NA)基因的核苷酸序列,设计HA基因的5′端第123~870位脱氧核苷酸和NA基因的5′端第417~1362位脱氧核苷酸特异性引物,以1株H5N1亚型禽流感病毒A/Swine/Fuiian/03 RNA为模板,通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,扩增了HA(核苷酸123~870位)和NA(核苷酸417~1362位)基因cDNA。将该片段克隆测序后定向插入到原核表达载体pET-his中,构建原核表达载体pET-HA和pET-NA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了HA基因和NA基因,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因和NA基因的最佳诱导条件:在37℃时,用终浓度为0.5mmol/L的IPTG,诱导时间3h。用镍柱分离纯化得到纯化的重组蛋白。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5N1亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,HA抗原的最佳包被浓度为320ng/孔,血清最佳稀释倍数为1:10,NA抗原最佳包被浓度为118ng/孔,血清最佳稀释倍数为1:10。对该方法进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和相关性试验,结果表明这种检测AIV血清抗体的间接ELISA方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为H5N1亚型禽流感检测试剂盒的研制奠定了基础。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.65

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