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《湖南农业大学》 2005年
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烟草种质资源遗传多样性及青枯病抗性基因的分子标记研究

杨友才  
【摘要】: 烟草起源于南美洲,是世界性重要的经济作物,作为世界上最大的生产与消费国,烟草在国民经济建设中占有重要地位。关于烟草分子标记技术及遗传多样性在DNA分子水平上的研究,于20世纪90年代中期开始在国内外均作了一些开创性的工作,但与其他作物相比,仍存在较大的差距。相对应用较多的只有RAPD标记,其他遗传标记的研究极少见。本研究试图从建立烟草基因组DNA多态性分析的RAPD、AFLP标记方法着手,并用建立的标记技术来研究烟草种质资源的遗传亲缘关系,并用BSA分析法对烟草青枯病的抗性基因进行了RAPD标记分析。本研究主要结果有: (1)采用CTAB法和SDS法提取烟草基因组DNA,经检测,结果表明:SDS法提取的基因组DNA的OD_(260)/OD_(280)值都在1.6左右,纯度不如CTAB法提取的高,CTAB法提取的基因组DNA,其OD_(260)/OD_(280)值都在1.8以上,相对分子量在21kb左右,且能完全被EcoRⅠ和MseⅠ酶切消化,并能获得清晰的AFLP指纹图谱。运用改良CTAB法可以获得适于烟草AFLP分析用的高质量的基因组DNA。 (2)通过对影响烟草RAPD反应的主要因子,包括DNA模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶用量、循环次数(次)、退火温度(℃)等进行研究,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系,即在25μl反应体系中模板含量为40ng;引物浓度为30ng/25μl:Mg~(2+)浓度为2.5mmol/L;dNTP浓度为0.25mmol/L;Taq DNA聚合酶用量为1U;其最佳循环数为39,退火温度为38℃。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃1min,72℃1.5min,39个循环:最后72℃延伸5min。 (3)通过对AFLP分析过程中的包括DNA模板质量与浓度、MseⅠ和EcoRⅠ以及T4DNA连接酶的浓度、反应时间和反应温度,以及反应体系的组成等影响因素进行了研究。建立了一种适于烟草分析的AFLP银染技术体系。该体系中各优化因素为:模板DNA的用量为400ng,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ各加入4U,T4 DNA连接酶加入2.8U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切连接温度为37℃,反应时间为7h。并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物E-ACA/M-CAC构建了烟草种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,条带清晰可辩。 (4)从200条10bp的RAPD引物中筛选获得28条多态性引物,通过对48份烟草种质资源的基因组DNA进行扩增。共获得184条DNA扩增片断带,其中多态性带86条,平均每个引物扩增出6.5条带,多态性带3条,平均多态检出率为46.7%。用4对AFLP选择性扩增引物对48份烟草材料进行选择性扩增,共获得321条扩增带,其中174条具有多态性,平均每对引物获得80.2条扩增带,多态性带43.5条,平均多态检出率为54.2%。从每对引物扩增出的带数、具多态性带数以及多态性比例来看,AFLP银染标记技术由于其对多态性检出的高效性和良好的重复性,将成为烟草种质资源遗传多样性及系统演化研究的有效手段。 (5)根据RAPD和AFLP标记的结果,采用UPGMA法进行聚类分析,两种方法获得了相似但不完全相同的结果,两者都可以将48份烟草资源分为两大类群,即黄花烟草群和普通烟草群,普通烟草可进一步分为4组;48份材料的遗传距离变幅在1.41~11.0之间,其聚类结果与理论上所期望的结果基本一致,但AFLP标记技术比RAPD标记技术能更好地从分子水平揭示我国烟草品种资源的遗传背景、亲缘关系及演化规律。 (6)采用温室苗期叶片人工注射接种法对生产上的烟草主栽品种进行青枯病抗性鉴定,结果显示Ti448A,D101,G80三个品种对青枯病表现高抗;表现中抗的有NC82、中烟90等17个,大部分品种表现感病或高感,没有发现免疫品种。 (7)通过选用高感青枯病品种红花大金元作母本与高抗青枯病品种Ti448A作父本进行杂交,经对两亲本及其杂交后代F_1、F_2、BC_1P_1代进行抗病性鉴定,研究青枯病抗性基因的遗传规律,结果表明,抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。 (8)依据混合群体分组分析法(BSA)建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池,通过RAPD试验,从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503,用双亲、F1、F2单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,利用JOINMAP(version 1.4)软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261cM。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S572

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3 李琳;4个节旋藻样品遗传多样性及亲缘关系的研究[D];内蒙古师范大学;2008年
4 刘民;利用AFLP分子标记技术对部分菊花品种遗传多样性的研究[D];河北农业大学;2007年
5 贺洁;RAPD标记和AFLP标记在朝天椒遗传多样性上的应用及比较[D];河南大学;2007年
6 王文峰;祁连山青海云杉天然群体遗传多样性ISSR分析[D];甘肃农业大学;2009年
7 孟庆文;红景天(Rhodiola rosea L.)种内遗传多样性的AFLP标记分析[D];新疆农业大学;2007年
8 王婷;忍冬种质资源调查及遗传多样性的初步研究[D];山东中医药大学;2008年
9 曾惠阳;RAPD和ISSR标记对果蔗种质遗传多样性的研究[D];福建农林大学;2006年
10 俞金蓉;苜蓿品种间遗传多样性的ISSR分析[D];西南大学;2007年
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