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《湖南农业大学》 2006年
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高产脂肪酶菌种选育与脂肪酶催化合成生物柴油

肖弥彰  
【摘要】: 本研究筛选了高产脂肪酶的菌种,并探讨其应用,意在提高酶的使用次数,降低其成本,并探索该酶在转化菜油时的催化特性。研究内容和结果如下: 1.从被油污染的土壤中分离微生物,通过油脂同化平板筛选产胞外脂肪酶菌株;诱变育种获得的部分菌株的发酵能力比原始出发菌株提高十倍以上;按照微生物分类学方法菌株被初步鉴定为假丝酵母、芽孢杆菌、米曲霉、假单孢杆菌。 2.对于上述四个高产脂肪酶的菌种的培养条件进行优化;将正常生长的菌种约十万株接种到50mL培养基中发酵一天(45℃),二十次试验中七次的发酵能力都高于10.8IU/mL(相当于国内文献报道数据11.4IU/mL的95%);其中5次的发酵能力超过国内文献报道数据的5%。 3.对高产脂肪酶的菌种进行了分子生物学研究,测得其序列,证明为新发现菌种。 4.通过盐析与层析等方法纯化发酵液中的脂肪酶。 对于假丝酵母所产脂肪酶,凝胶材料HNO-E最合适;芽孢杆菌所产脂肪酶,凝胶材料HNO-E、HNO-A、HNO-B的分离效能比较好;米曲霉菌所产脂肪酶,HNO-A的分离效能最强;假单孢杆菌所产脂肪酶,凝胶材料HNO-E的分离效能最强。 5.探索合适的脂肪酶载体,并通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制;得到的固定化脂肪酶易于在固定床和流化床反应器中使用,性能接近脂肪酶Lipozyme~(IM)。 6.对于各种微生物所产脂肪酶,固定化最合适的条件是:每克载体的给酶量为500U;温度为30℃;pH8.0;固定化时间为120min,载体是硅藻土。 7.应用发酵生产的脂肪酶将菜籽油转化成了生物柴油;最佳条件为:油/甲醇的摩尔比为1/3、反应温度为40~50℃、固定化酶用量5%(wt)。分段添加甲醇进行反应利于保持固定化脂肪酶的活力;油脂组成影响反应转化率;来自假丝酵母等的脂肪酶对于油酸具有一定的底物特异性,原料中各脂肪酸酰基被转化(与醇氧基结合)的先后顺序为C_(12:0)、C_(14:0)>C_(16:0)、C_(18:0)>C_(18:1)>C_(18:2)、C_(18:3)。 分析了液体发酵产脂肪酶进程与催化进程的联系;有机相酯交换催化酶活和水相水解酶活相关性不高,酯交换酶活与水解酶活出现高峰时间不一致,原因是测定脂肪酶的反应条件及反应动力学不相同;液体发酵产脂肪酶进程中水解酶活高峰的出现先于催化酯交换酶活高峰12h。 本研究取得如下创新: 1.筛选得到了高产脂肪酶的四个菌株,并且优化了微生物的培养条件。 2.对高产脂肪酶的菌种进行了基因序列分析,证明为新发现菌种 3.证明了发酵脂肪酶适合转化油酸含量中等的菜籽油成为生物柴油;并且获得了良好的生产效果。 4.通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制;对催化反应动力学方程进行了推导。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TE667

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