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《湖南农业大学》 2006年
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三叶半夏病毒病和细菌病的鉴定、检测和侵染特性及脱毒组培研究

何煜波  
【摘要】: 三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb)Breit)是天南星科(Araceae)三叶半夏属(Pinellia)多年生草本植物。其干燥块茎为常用中药材之一,已有2000多年的用药历史。三叶半夏主要产于长江流域各省以及东北、华北等省区。在558种中药处方中,三叶半夏列为第22位使用频率最高的药材。 由于野生资源的日益减少,许多地方开始采用人工栽培的方法进行三叶半夏种植。但在三叶半夏栽培区中病毒病和软腐病导致了三叶半夏种质逐年下降甚至绝收。本研究对侵染三叶半夏的病毒和细菌进行了鉴定。对病原物的侵染特性、检测技术和三叶半夏脱毒组织培养技术体系进行了探讨。 一、三叶半夏病毒病研究 1、病毒鉴定:三叶半夏病株呈斑驳、典型花叶、皱缩、叶片变小、沿脉变色、植株矮化及畸形等症状。电镜显示有两种病毒粒体,一种为直径35nm的球形病毒粒子和长度为750nm的线状病毒粒子。病毒复制期间的双链RNA提取和电泳检查、RT-PCR和ELISA检测结果表明它们分属于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)和大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)。 2、三叶半夏带毒率调查:经ELISA法检测,来自浙江宁波、浙江萧山、河北、安徽、四川南充、北京、江苏丰县七个地区的栽培三叶半夏的CMV检出率分别为75%、100%、63%、30%、5%、0%和30%;SMV检出率分别为35%、30%、40%、25%、0%、25%和30%;复合检出率分别为25%,10%,20%,25%,0%,0%和5%。来自全国各地的25份野生三叶半夏样品中,CMV、SMV,以及复合检出率分别为:20%,20%和16%。检测结果表明,CMV和SMV在栽培的和野生的三叶半夏中均存在,但野生三叶半夏的带毒率明显低于栽培三叶半夏。 3、病毒侵染三叶半夏的特性:侵染三叶半夏的CMV不能通过摩擦接种感染三叶半夏和普通烟、苋色黎、昆诺藜和克氏烟;而CMV的番茄分离物和普通烟的分离物可以摩擦接种感染三叶半夏。同时来源于三叶半夏和大豆的大豆花叶病毒均可以摩擦接种三叶半夏无毒苗。 二、三叶半夏软腐病研究 1、病原鉴定:软腐症状常常表现在人工栽培的三叶半夏块茎上,在高温高湿条件下则可能导致叶面腐烂和整株死亡。从已软腐病株分离到10个细菌菌株,定名为RF1~RF10,对这些菌株进行了致病性鉴定、电镜观察、细菌学性状测定和生理生化鉴定,并对RF1进行了分子鉴定。结果表明,这10个菌株均可导致三叶半夏、胡萝卜、土豆、番茄、黄瓜和白菜软腐。病原细菌在电镜下呈两端钝圆的短杆菌,4-6根周生鞭毛,兼性厌氧、革兰氏阴性,其DNA的G+C摩尔比为51%。RF1菌株的16S rDNA基因测序和系统发育学分析表明其与胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)M1菌株报告的序列完全相同,与E161菌株和441菌株的序列相似度达97~98.5%。结果表明三叶半夏软腐病原菌应属于胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种(P carotovorum subsp.carotovorum) 2、病原细菌的胞外酶检测:在接种胡萝卜软腐果胶菌RF1后24小时,三叶半夏小植株的细胞提取液中果胶酶的活性较对照组提高8倍;蛋白酶的活性较对照组提高12倍以上,而纤维素酶活性近乎为0。在对RF1的离体培养过程中同样检测到了较高的果胶酶和蛋白酶活性。 三、三叶半夏组培脱毒研究 1、组培污染菌的鉴定和消除:分离到3株导致三叶半夏组培物污染的芽孢杆菌。经形态学和生理生化试验,鉴定为环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。在含30mg/L的青霉素或30mg/L的氨苄青霉素的培养基内连续继代3次可以消除细菌的污染,同时不影响瓶苗的生长。 2、三叶半夏组培苗病毒检测技术比较:以三叶半夏18S rDNA基因为内参照,对携带CMV的三叶半夏组培苗的各部分进行了相对定量Real Time PCR检测,并以ELISA和RT-PCR检测结果相比较。结果证实,来自CMV阳性母株的组培苗叶片中的病毒浓度较块茎和愈伤组织中的高;组培苗的CMV浓度较母株大大降低。ELISA方法在对组培苗中含有的超低浓度的病毒进行检测时可能出现假阴性结果;RT-PCR方法灵敏度更高,但不能精确量化病毒的浓度。而Real Time PCR方法具有更好的精确度和量化性。试验结果还提示我们在组培过程中病毒浓度随着扩繁的进行而下降,进行脱毒组培时应该选取Real Time PCR等灵敏度更高的检测方法。 3、通过茎尖脱毒技术得到的三叶半夏组培丛生芽可以稳定继代20次。合适的继代周期为20天。大田生长速度对比试验的结果表明,脱毒组培苗的块茎增重速度较带毒非组培块茎高25%。不外加任何处理使生根苗自然倒苗形成离体小块茎直接用于大田播种时成活率近100%。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S435.672

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