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《湖南农业大学》 2006年
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油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究

张志刚  
【摘要】: 油菜是世界范围内广泛种植的油料作物,是世界食用植物油和植物蛋白的重要来源,近十年来其种植面积不断扩大,目前已成为世界第二大植物油来源,在国际农产品贸易中占有重要的地位。植物油是栽培油菜的主要农产品,它不仅是人和动物必须脂肪酸的主要来源,也是生产油漆、润滑剂、化装品、尼龙等化工产品的重要原料。与加拿大等国家相比,我国多数油菜品种的含油量偏低,尤其是长江流域冬油菜主产区的菜籽含油量比加拿大的低2~3个百分点,因此,高含油量油菜育种品质育种具有十分重要的现实意义。。 植物油的含量与丙酮酸羧化酶(PEPC)和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT;EC2.3.1.20)密切相关。丙酮酸羧化酶(PEPC)控制油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮的流向,从而决定植物种子蛋白质/油脂含量比例:二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT;EC 2.3.1.20)是催化三脂酰甘油(TAG)合成的最后也是最关键的限速酶,对植物种子中的油脂含量具有十分重要的调控作用。为了提高油菜种子中的含油量,本研究从拟南芥及油菜中分别克隆DGAT基因及PEPC基因片断,构建DGAT及反义PEPC种子特异性表达载体,通过农杆菌共转化的方式将DGAT及反义PEPC基因导入油菜,使其在同一株植物中表达。一方面抑制种子中PEPC基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,另一方面加快油脂合成速度,减少反馈抑制,以望获得高含油量的转基因油菜。 主要结果如下: 1 DGAT基因的克隆及其种子特异性植物表达载体的构建 用同一对引物从拟南芥花柱基因组和总RNA中扩增了DGAT全长编码基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明:拟南芥DGAT基因的DNA长3020 bp,cDNA长1563bp。对测序结果进行比较发现,该基因由16个外显子和15个内含子组成,编码520个氨基酸蛋白,推测其分子量为59.0kDa,等电点pI=8.53。 将拟南芥DGAT酶蛋白序列与油菜、大豆、烟草、水稻的DGAT酶蛋白序列比较,发现它们同源性较高,分别为89%、73%、69%、66%,而与动物(鼠)的同源性较低,只有38%的同源性。同Kenndy途径中的3-磷酸甘油酰基转移酶(G3PAT)、溶血性磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)比较,发现没有很大的相似性,表明它们并不相关。 用扩增引物上设计的BamHI酶切位点将DGAT基因切下,插入到pBI121.N质粒的Napin启动子BamHI酶之后,构建种子特异性表达载体,经过平PCR和限制酶切的方法筛选到DGAT正义表达载体,将DGAT cDNA重组正义表达载体命名为pBI121.ND_1,DGAT DNA重组正义表达载体命名为pBI121.ND_2,通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404,并经菌落PCR验证。 2.PEPC基因片段的克隆和种子特异性反义PEPC基因植物表达载体的构建 利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEPC基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yanai报道的PEPC基因相应区域的同源性为95%。用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEPC表达载体pBI121.NP。通过冻融法将pBI121.NP转化农杆菌LBA4404,并经菌落PCR验证。 3.甘蓝型油菜的遗传转化和转基因植株的获得 对甘蓝型油菜子叶节再生体系和遗传转化体系进行了优化,通过农杆菌共转化的方式,将DGAT cDNA种子特异性正义表达载体及PEPC反义表达载体基因转化到湘油15号,获得了抗卡那霉素油菜转基因苗,经PCR检测和Southern杂交分析,DGAT或反义PEPC基因整合到湘油15基因组中植株共11株,其中2株同时转入PEP和DGAT基因,5株只转入PEPC单基因的,4株只转入DGAT单基因。 4.转PEPC及DGAT基因在油菜中的表达及对种子内油脂和蛋白质代谢的影响 研究发现DGAT在转基因植株中均能表达,在油菜种子中表达水平高,在叶中以低水平表达。转反义PEPC基因的植株种子中的PEPC活性下降,最多的可下降21.5%。11株转基因油菜种子中的油脂含量及种子重量普遍增加,其中油脂含量增加0.7~6.9个百分点,代表总净量增加1.7~17.4%,以同时转入PEPC和DGAT两个基因植株油脂含量增幅效果好;而蛋白质的含量则有不同程度的降低,下降幅度为5~11%左右,相关分析表明:种子中的蛋白质含量与油脂含量呈显著的负相关,相关系数为—0.8801。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S565.4

【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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