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《湖南农业大学》 2007年
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真菌蛋白激发子诱导棉花抗病增产的作用机制及其基因对棉花遗传转化的研究

张志刚  
【摘要】: 蛋白激发子是从葡萄孢菌(Botrytis)、细极链格孢菌(Alternaria)、黄曲霉菌(Asporgillus)、稻瘟菌(Pyrcularia)、青霉菌(Penicillium)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、木霉菌(Trichoderma)、镰刀菌(Fusarium)等多种真菌中分离出的一类新型蛋白质,具有诱导植物抗性、提高植物免疫力的功能。不同来源的蛋白激发子在理化性质上略有差异,但生物活性相似或接近。本研究使用的细极链格孢菌蛋白激发子是从真菌细极链格孢菌中提取的蛋白激发子(protein elicitor from Alternaria tenuissima,PEAT)。核酸和氨基酸序列分析表明,PEAT完全不同于过敏蛋白和隐地蛋白,2002年已申报中国专利(CN1344727A)。目前对此类蛋白激发子的理化性质、作用机理、活性测定等理论研究方面还比较薄弱。为此,本论文研究了该激发子对棉花生长性状的影响以及抗病增产的作用机制,主要结果如下: 1.PEAT能促进棉种萌发、提高发芽率,并能显著促进根的生长。无论是采用快速纸培发芽法还是沙培发芽法,PEAT处理棉种均能促进棉种萌发和提高发芽率,并能显著促进根的半径增大及根快速生长,尤以处理浓度3μg·mL~(-1)+浸泡6h的处理效果比较显著。 2.PEAT能显著改善棉花的农艺形状,提高棉花产量和品质。从主要农艺性状与经济性状来分析,PEAT能显著提高棉花成铃数且不同程度提高了株高、单铃重、衣指、子指和衣分,降低了单铃壳重,特别是促进棉花早熟,获得了较好的产量,以浸种处理的籽皮棉产量分别达到3800.60kg·hm~(-2)、1598.15kg·hm~(-2),比对照提高了22.15%、26.11%。;从纤维品质来看,适时适度喷施棉株,纤维各个指标均得到了明显的改善,尤以浸种+现蕾期喷雾处理的综合值最高,比对照提高了6.1%。 3.PEAT诱导可以提高棉花生长功能叶的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、外界光合作用有效辐射等。延缓叶片的衰老和光合功能衰退,延长了叶片的光合功能期,使光合速率维持在一个较高的水平。 4.PEAT诱导后NR、C/N、SOD,POD及MDA含量均有不同程度的变化,具体表现为棉花叶片POD、SOD、NR、C/N比对照增加,而MDA含量比对照减少。由此造成细胞内氧化还原态势的改变和下游信号转导的活化,启动植物体内一系列代谢反应,激活植物自身生长系统、防卫系统,从而使植物产生对病虫害的抗性,促进生长,提高作物产量。 5.利用抑制差减杂交技术,构建了棉花苗期基因表达文库,筛选获得104个序列并进行了功能比对,涉及到植物生理生化的多条途径,包括抗病与防御蛋白,信号传导蛋白,转录因子,能量代谢相关蛋白,抗逆相关蛋白,细胞保护机制蛋白等。从2080个重组克隆种,随机选取150个克隆进行菌液PCR检测与测序,插入片段的大小主要集中在200bp—1kb之间。并将所测序列与GenBank dbEST库进行比对,共得到104个单一序列。其中,78个EST与其它物种已知基因部分区域的同源性为48.54%~100%,占总EST的75%;6条EST序列能在数据库中检索到同源性序列,但其功能尚不清楚,占5.77%;10个EST能在数据库中发现为推测蛋白,占9.6%;10个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列,可能是新基因,占9.6%。同时,将所得到的104条EST序列在WEGO网站上进行功能分类,通过Gene ontology确定具体EST的分子功能。其中,在生物途径分类中,与生理途径和细胞过程相关的EST最多,分别为48个、45个;在细胞组份功能分类中,与细胞相关的EST最多,达到44个;在分子功能分类中,催化功能与分子绑定相关的EST数量最多,分别达到了30个、28个。 6.建立起了一套适合棉花的蛋白质双向电泳的技术体系。首先采用三氯乙酸/冷丙酮(—20℃)沉淀法提取蛋白质。试验将冷丙酮沉淀的次数增至三次,采用10—15℃下15000r/min离心1h,得到浓度、纯度均较高的蛋白质样品。第一向等电聚焦电泳采用分步升压,其中S_1的水化时间最好为15h,S_2的除盐过程改为3h,S_3的除盐过程为1h,S_4的升压过程为6.5h,S_5的聚焦过程为0.6h,最后聚焦总伏特数达到8000V左右。平衡时间改进为第一步为20min、第二步为15min的平衡程序,从而减轻了第二向电泳中的蛋白质点纵向拖尾现象。第二向SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳(T=12%)的最佳参数设置为稳流15mA进行电泳45min,待样品完全跑出胶条,指示剂浓缩成一条线后,加大电流至35mA直至电泳结束。 7.通过双向凝胶电泳软件分析,蛋白质分子质量在10-100KD之间、等电点3-10范围内,每块胶分离到约600个蛋白质点。得到了大约53个差异蛋白点,其中有31个为上调蛋白,22个为下调蛋白。对PEAT诱导后表达量明显增加的7个上调蛋白点用用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测,获得了4个蛋白的肽质量指纹图谱,经数据库检索鉴定分析,GH-1、GH-3、GH-6推测为核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因家簇,GH-7推测为S-腺苷—蛋氨酸合成酶。 8.研究确定了温室盆栽棉花经诱导后对棉花黄萎病病原菌的抗生作用,并测定了抗病相关的酶活变化。供试的4个浓度蛋白粗提蛋白液均可不同程度地降低棉苗黄萎病的发病率和病情指数,其中3ug·ml-1浓度诱抗效果最好,诱抗效果达67.7%。同时,对一些生化指标进行测定发现,PEAT诱导处理引起棉苗叶片中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO);几丁质酶的活性升高,与此同时丙二醛(MDA)含量则表现为下降,在此基础上对细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉花耐黄萎病的可能生化机制作了探讨。 9.利用本研究室克隆的蛋白激发子基因pem~(g1),成功地构建了可用于转化棉花的表达载体pBI121-pem~(g1)和PCAMBIA-pem~(g1),用花粉管通道法转化陆地棉品种Z-1、Z-2、Z-3,获得了转基因植株,其中,pBI121-pem~(g1)获得Kan~r植株48株,PCAMBIA-pem~(g1)获得bar~R植株10株。并对转基因棉花材料进行PCR分子生物学检测,证明Kan与bar~R抗性植株中外源pem~(g1)基因可能已整合到受体植株的基因组中,但还需进一步形成株系后,进行病圃抗病性鉴定。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S562

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【参考文献】
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