生防木霉菌对土著根瘤菌固氮活性及遗传多样性影响的研究

【摘要】： 为揭示木霉菌TU-3发酵产物增强土著根瘤菌结瘤固氮能力与机制。本论文利用自行选育的木霉菌TU-3摇瓶发酵产物，滤去菌丝体和孢子后，按10％(V／V)添加到土著根瘤细菌的液体培养基中，培养60h，将其划线分离，得到土著根瘤菌的纯培养物，比较分析了处理菌株与出发菌株表型性状的差异，并运用RAPD、ISSR、AFLP等分子标记技术、16S rDNA全序列分析等分析它们间的遗传多样性。同时，将其作为接种剂，接种到豇豆根部，研究其与出发菌株所结根瘤的结构、固氮酶活性的差异，及豆血红蛋白、Fe元素、赤霉素等5类植物生长调节物质含量变化。采用AFLP分子指纹技术检测了木霉菌对土著根瘤细菌竞争结瘤能力的影响；此外，还比较了RPAD与ISSR两种分子标记技术对根瘤菌种间遗传多态性分析的灵敏度、准确度，获得了以下结论： 经木霉菌TU-3发酵产物处理的土著根瘤菌对豇豆根部的亲和力和侵染力增强，促使豇豆根系中心组织加快分化形成根瘤组织，使寄主比对照提早2天结瘤，根瘤提前3天具有固氮活性；所结根瘤数为对照的1.54倍，竞争结瘤能力为对照的1.53倍。经处理的土著根瘤菌与出发菌株的表型性状存在较大的差异，多数处理菌株与出发菌株的相似系数仅为56.12％，差异主要表现在对抗生素、盐碱及高温耐受性等方面。经处理的土著根瘤菌能改善根瘤的结构，其中心组织受侵染细胞数增多，体积增大，细胞质丰富；受侵染的细胞中类菌体数量多于对照，液泡少而小，聚-β-羟基丁酸较早形成，有利于提高根瘤固氮能力。经处理的土著根瘤菌所结根瘤中豆血红蛋白含量提高了1.54倍，含铁量提高了1.16倍，固氮酶活性提高了1.65倍。同时改善了根瘤中不同植物生长调节物质的正负向调控，其Z／GA，Z／IAA的比值均显著高于出发土著根瘤菌所结根瘤的，对其固氮活性产生正向调控。IAA／ABA、GA／ABA的比值中，处理均低于对照，对根瘤固氮活性未产生负向调控作用。从田间随机分离的9个豇豆土著根瘤细菌与其相对应的经木霉菌处理菌株，ISSR技术比较结果表明，所有出发菌株在0.54聚为一类，处理菌株则在0.67聚为一类。18个菌株也表现出遗传多态性。同时，通过对其中的CK1菌株进行竞争结瘤及遗传稳定性实验，结果也表明，经木霉菌处理的1号菌株在160bp左右处明显比出发菌株多出一条谱带。在300-600bp之间，处理菌株与出发菌株的谱带也存在差异。对这个1号菌株的16SrDNA全序列分析结果表明，供试土著根瘤菌被木霉菌TU-3发酵产物处理前后，两者的同源性为93.9％，其中有7.1％的碱基发生了变异，发生变异的碱基分布比较零散，只有在421—455碱基处变异的频率比较高，达到了47.06％。证明木霉菌发酵产物可诱导土著根瘤菌遗传物质DNA发生变异。此外，筛选出的5个ISSR引物扩增出的多态性条带比率为75.63％，筛选出的6个RAPD引物扩增出的多态性条带比率为68.65％。同时，用筛选出的引物对模板DNA进行PCR扩增，结果显示，用RAPD标记与用ISSR标记检测出的遗传相似趋势相近。但在这个遗传相似系数范围内，RAPD标记的各菌株被聚为六类，而ISSR标记的各菌株被聚为十类。即RAPD标记较ISSR标记可提高供试材料间的遗传相似性，也即ISSR更能检测和发现供试根瘤菌种内的遗传差异性。表明ISSR技术检测土著根瘤菌的多态性的效率优于RAPD技术检测土著根瘤菌。