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《湖南农业大学》 2007年
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叶下珠保肝护肝有效成分的分离及HPLC指纹图谱研究

范适  
【摘要】: 叶下珠(Phyllanthus urinaria L.)为大戟科叶下珠属植物,是我国传统的中草药。在我国长江流域和南方诸省都有分布,是一种资源十分丰富的植物。现代药理实验证明叶下珠有抗乙肝病毒和保肝护肝的药理作用,且无毒副作用。但其发挥药效的物质基础还不清楚,同时,中药受产地、采收期、药用部位、加工方法等因素的影响,导致药材质量的明显差异,从而影响临床疗效。本研究采用现代分离纯化技术逐级分离叶下珠的有效成分,同步采用体外细胞学活性筛选(采用新生大鼠原代肝细胞四氯化碳化学性损伤药理模型,MTT法)及动物试验,对叶下珠保肝护肝的活性成分进行追踪,并对得到的单体化合物进行四谱(IR、UV、MS、NMR)鉴定。同时,应用HPLC法对叶下珠药材及叶下珠胶囊色谱指纹图谱进行了系统的研究,建立叶下珠药材及叶下珠胶囊的标准指纹图谱,为叶下珠植物药的开发应用提供理论依据及为我国中药现代化打下基础。 主要研究结果如下: 1.采用体外细胞学活性筛选法,首次对叶下珠保肝护肝有效成分进行了追踪分离研究,得到了叶下珠保肝护肝有效部位,从有效部位分离得到5个单体化合物,通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振、质谱等波谱分析,鉴定叶下珠保肝护肝有效成分为柯里拉京(corilagin)。 2.叶下珠保肝护肝有效部位(PE)抗小鼠四氯化碳化学性肝损伤的试验结果表明:PE能够明显降低CCl_4致小鼠肝损伤所致ALT、AST增高,减轻肝细胞变性、炎症细胞浸润等病变,降低肝中MDA生成量,提高SOD活力,提高ALB的合成量,提高A/G值,因此,PE具有明显的保肝护肝活性。 3.本研究首次对叶下珠不同产地、不同采收期、不同部位的药材进行了系统的HPLC指纹图谱研究,确定18个共有峰构成叶下珠药材的特征指纹图谱,确认了其中四个特征峰:2号峰为没食子酸,3号峰为原儿茶酸,6号峰为咖啡酸,8号峰为柯里拉京。所建立的特征指纹图谱具有好的专属性、稳定性、重现性,且能反映不同产地、不同采收期、不同部位药材的差异。 使用计算机辅助相似度评价软件进行数据处理,对不同产地的叶下珠药材进行了相似度分析,结果表明:除3号药材(浙江杭州)和8号药材(云南昆明)外,其它各产地药材的相似度都在0.9以上。 叶下珠不同采收期的7批药材相似度良好,都在0.94以上。比较各个特征峰的表观丰度,发现特征峰的表观丰度(即成分的含量)大多数随生长期而增高,至10月5日达到最高,过后则明显降低,建议叶下珠药材的采收期为每年10月上旬。 对叶下珠不同部位的药材相似度进行了评价,叶、果部分与共有模式的相似度在0.94以上,而根、茎部分与共有模式的相似度在0.9以下,应该是由于各成分在含量上的差异所致。对各特征峰的表观丰度进行比较,发现各特征峰在叶中的含量最高,其次为果、茎,最低为根。由于根所占比例不到20%,且各成分含量又很低,因此,建议只采收地上部分。 4.建立了叶下珠药材保肝护肝有效成分柯里拉京含量的HPLC测定方法。在0.458~4.580 mg/g质量浓度范围内,柯里拉京的色谱峰面积与样品浓度呈良好的线性关系,回归方程为:Y=302 172X+22 305,相关系数r=0.995 9,加样回收率为97.98%。不同产地药材含量差异较大,平均为2.288 mg/g,产地为广东中山的含量最高,达4.224 mg/g,产地为浙江杭州的含量最低,仅为0.982 mg/g。采收期为10月5日时柯里拉京的含量最高,为4.090 mg/g。不同部位中以叶的含量最高,达4.437 mg/g,其次为果、茎,根的含量最低,仅为叶的1/5。 5.建立了叶下珠胶囊HPLC指纹图谱。确定17个共有峰构成叶下珠胶囊的特征指纹图谱,共有峰面积在90%以上,确认特征指纹图谱中的3个特征峰:3号峰为没食子酸,4号峰为原儿茶酸,8号峰为柯里拉京,10批叶下珠胶囊具有良好的相似度(在0.9以上),说明叶下珠胶囊一致性好,质量稳定。对比并分析了叶下珠胶囊与对照药材的HPLC指纹图谱的相关性,结果表明,叶下珠胶囊与对照药材化学成分基本一致,但某些特征峰的表观丰度相差较大,应该是叶下珠胶囊加工过程所致。 6.建立了叶下珠胶囊保肝护肝有效成分柯里拉京含量的HPLC测定方法。在8.400~42.000 mg/g质量浓度范围内,柯里拉京的色谱峰面积与样品浓度呈良好的线性关系,回归方程为:Y=199 850X-608 070,相关系数r=0.999 8,加样回收率为98.51%。各批叶下珠胶囊柯里拉京的含量较稳定,在17.19 mg/g~21.84 mg/g之间,平均含量为19.82 mg/g。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R284

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