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《湖南农业大学》 2007年
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三角帆蚌瘟病的病原病理及免疫相关因子筛选与表达分析

肖调义  
【摘要】: 三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是中国特有的最主要的淡水育珠蚌种。三角帆蚌瘟病是严重危害淡水珍珠生产的传染性蚌病,该病传染快、死亡率高、治疗难度大;由于缺乏贝类免疫系统与免疫机制研究,且双壳贝类的形态特点也给及时发现与防治疾病造成了诸多不便,因此,三角帆蚌瘟病常引发灾难性后果,受其影响,中国淡水珍珠产业几度兴衰。 20世纪80年代开始的三角帆蚌瘟病病原相关研究一直存在病毒与细菌两类病原的报道。本研究以2005年9月采集的三角帆蚌瘟病典型症状病蚌为基本材料,从病蚌组织的病毒分离提取、纯化入手,在研究三角帆蚌瘟病病毒(Hyriopsis cumingiiplague virus,HcPV)的形态与分子结构特征基础上,系统探讨了病毒复感健康三角帆蚌的组织病理变化特点;为探索三角帆蚌瘟病的抗病育种技术途径与方法,应用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH),初步建立了三角帆蚌肝脏cDNA文库,筛选分析三角帆蚌瘟病的免疫相关因子。论文的主要研究内容和结果如下: 1.HcPV的形态与分子结构特征 对典型症状的频死病蚌组织进行灭菌处理后,经差速、蔗糖密度梯度离心,负染,电镜下观察到大量病毒粒子,其形态为圆形或椭圆形,直径20-310nm,无囊膜包裹,表面布满纤突;病毒经三次传代复感后,实验致病死亡率仍然达90%以上,病毒粒子主要沉积在30%-50%蔗糖密度条带;在有明显病理症状的三角帆蚌组织的电镜超薄切片可清晰见到病毒颗粒。这些病毒形态可区别于前人报道的HcPV。 收集差速离心提取的病毒,经分子生物学手段鉴定,可知病毒为3节段、双链RNA型病毒;病毒分子量0.2-3.0kb。以病毒RNA为模板,用随机六聚体引物扩增构建该病毒的cDNA文库,随机挑选45个克隆进行测序,在得到的38个有效序列中,首次发现有5个阳性克隆序列(E值>-6)未见接近的同源序列;推测所得的5个序列可能是HcPV的新基因序列片段。 2.三角帆蚌瘟病的组织病理变化特点 光学显微镜和电子显微镜分别观察三角帆蚌瘟病病理组织,可相互弥补各自观察视野的局限性。本研究按攻毒后3、5、7、9、11天不同时间各组织的病理变化进行了制片观察,电镜结果表明,病毒对蚌组织结构的主要影响是:细胞核、线粒体、内质网等细胞器肿胀变形,严重时膜结构断裂溶解,最后形成空泡;光学显微镜下主要表现为各组织上皮细胞肿大变形,排列不整齐,甚至脱落溶解,嗜碱性增强,黏液细胞增多,结缔组织细胞和肌纤维破裂溶解,最终形成空白区域。从各组织的病理变化程度来看,病毒在肝脏、胃和中肠中增殖最快,产生影响的时间最短,对组织的破坏也最严重,其次是外套膜,对鳃和斧足也有一定的破坏作用。 3.三角帆蚌肝脏消减cDNA文库构建及其序列分析 采用抑制性消减杂交技术,构建了健康三角帆蚌和抗病三角帆蚌(攻毒后健康存活者)肝脏的消减cDNA文库,随机挑取107个cDNA克隆进行了单向测序,共获得有效cDNA序列87个。 序列同源性搜索结果显示,在87个有效cDNA序列中,有58个克隆和GenBank中的已知功能的序列具有较高的同原性(E值<-6);4个则与未知功能的开放阅读框具有较高的相似性,称之为假定蛋白;1个序列则没有任何相似的序列,很有可能是以前没有鉴定过的EST序列或是5'-或3'-UTR序列。82个已知功能的EST分别属于23个不同的基因,均为三角帆蚌的首次报道。 根据Adams对功能基因的分类方法,所获得EST分为8类:细胞分裂相关、细胞结构与运动相关、代谢相关、信号传导相关、细胞防疫相关、基因与蛋白表达相关(含转录调控、翻译、核糖体结构和蛋白质翻译后的加工)、其它功能蛋白和未知功能蛋白等。其中细胞防御、代谢和功能蛋白表达等免疫相关因子序列的克隆数达46个,占总克隆数的52.87%。 4.三角帆蚌类PIT 54序列分析与组织特异性表达 利用Clustal W,1.83软件,预测了三角帆蚌类PIT 54(EX828677)的氨基酸翻译序列,通过三角帆蚌、红原鸡、草鱼、家鼠、牛、猪、人等进化阶层代表生物的PIT 54或HP的氨基酸序列比对得知:三角帆蚌类PIT 54的预测氨基酸序列与红原鸡PIT 54的氨基酸序列相似性最高,为35.04%;其余依次为人13.87%,草鱼13.56%,家鼠13.14%,牛11.68%,猪11.68%。利用MEGA4.0软件构建的基因进化系统树证实了该基因与物种进化相一致的发育进程。 三角帆蚌类PIT 54基因在不同组织间表达的半定量RT-PCR结果表明,在心、肝脏、肠、外套膜、鳃和斧足中,诱导和未诱导的个体中都只在肝脏中有表达,诱导蚌表达量高于未诱导蚌;可能预示该基因在机体受侵时表达量上调。 本文的研究结果为三角帆蚌病毒性瘟病的病原病理和分子抗病育种等方向的系统研究奠定了较好的理论基础,对进一步研究三角帆蚌瘟病的防治对策具有现实的指导意义。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S944.2

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【引证文献】
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