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《湖南农业大学》 2008年
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甘露聚糖酶Man23的基因表达体系优化及其分子改造

周海燕  
【摘要】: 来源于枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis B23的甘露聚糖酶Man23具有较高的酶活力和较好的热稳定性。为了进一步提高酶的活力、稳定性和表达水平,笔者在生物物理学、生物化学和分子生物学理论的指导下,运用蛋白质工程和基因工程的技术体外改造甘露聚糖酶Man23的基因及其表达体系。 笔者采用常规方法从Bacillus Subtilis B23中克隆出甘露聚糖酶Man23的基因,连接到不同表达载体上,并转化至不同宿主细菌中,比较载体和宿主细菌对基因表达水平的影响,建立更为优良的基因man23表达体系。 由优化的表达体系生产甘露聚糖酶Man23,对其进行分离纯化,获得电泳纯的酶Man23,以半合理设计的策略为指导,分析鉴定该酶的活性中心区域并加以改造,以期提高催化效率。通过对酶Man23的化学修饰初步研究了它的化学性质,掌握了酶分子中对其活性有显著影响的残基种类,同时,运用生物信息学软件来分析酶Man23的初级结构、二级结构和高级空间结构的特点,结合生物物理学的理论和丙氨酸扫描技术确定影响酶活力的位点,并对选择的可疑位点进行饱和突变,通过酶活力测定、突变酶反应动力学测定等对突变库进行筛选,保留高酶活、高效率的突变。 此外,在对酶的稳定性进行研究的过程中,首先运用生物学软件分析了对稳定性有影响的各因素,如氢键、分子表面电荷分布、分子间键角等,根据分析获得的信息来优化各因素,建立突变体模型,以酶的耐受温度、长效试验等的测定结果为依据,筛选并保留高稳定性的突变。同时,对酶的微环境也进行了优化,分别添加多元醇、防腐剂、金属离子、糖类物质等,经正交试验确定保持液态酶稳定的复合稳定剂配比。 研究结果表明,p43启动子能够显著提高甘露聚糖酶Man23基因的表达量,同时蛋白酶缺陷型芽孢杆菌用来作为基因表达的宿主菌也明显降低了目的酶的体外降解程度,重组的pHY-p43-man23表达质粒转入枯草芽孢杆菌WB600和Brevibacillus brevis细胞中构建成功的表达体系明显提高了目的蛋白酶的表达量,去除了多数的杂蛋白。 此外,研究中还建立了半合理设计方法来分析甘露聚糖酶Man23的活性中心区域,通过传统的化学修饰法、丙氨酸扫描法和定点饱和突变法,结合计算机辅助分析软件,确定了甘露聚糖酶Man23的活性中心氨基酸及其位点。从化学修饰反应结果可得出,甘露聚糖酶Man23的最大吸收峰在336 nm,荧光光谱表现为色氨酸,且该残基位于酶蛋白分子内部的疏水区域,半胱氨酸残基为该酶的必需基团并形成了一个链内二硫键,羧基(Glu/Asp)和色氨酸残基也是该酶的活性必需基团。丙氨酸扫描和定点饱和突变结果表明D91和E191是参与酶Man23催化反应的关键位点,H129、H190、W196、F197、W198和W199是与底物结合过程相关的位点。 从共价键分布与数量、分子表面电荷分布和立体键角合理性等影响分子稳定性的几个因素出发,在分析软件辅助下做定点突变,确定与目的酶的稳定性相关的位点,由饱和突变定向选择突变体,找到16个明显提高酶Man23稳定性的点突变体。整合上述突变位点,最终获得了在23个位点引入有效突变的目的酶表达基因,转化至B.brevis后产生的总蛋白含量提高了近3倍,突变酶M0710的甘露聚糖酶活力提高了10多倍,80℃下半衰期延长了3倍。 对突变酶M0710的稳定剂也做了初步研究,单一因素试验考察了多元醇类化合物、防腐剂、金属离子和糖类化合物等对目的酶稳定性的影响,其中山梨酸钾、Na~+、K~+、Ca~(2+)、蔗糖、乳糖对酶的稳定性有明显效果,通过正交试验最后确定效果最佳的液态酶M0710的稳定剂为山梨酸钟3%、氯化钠2%和蔗糖2%。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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1 李慧玲;高产β-甘露聚糖酶菌株选育、构建及其酶学特性研究[D];东北林业大学;2014年
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8 靖德军;β-甘露聚糖酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究[D];四川农业大学;2013年
9 胡文波;β-甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];河南师范大学;2012年
10 朱泾;硫化叶菌内切β-1,4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆、表达与功能分析[D];华中农业大学;2011年
【参考文献】
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【共引文献】
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9 王静;成团泛菌甘露聚糖酶的体外定向进化[D];华中农业大学;2013年
10 靖德军;β-甘露聚糖酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究[D];四川农业大学;2013年
【二级引证文献】
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9 张稳;β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及分子改造[D];南京农业大学;2016年
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【二级参考文献】
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1 周海燕,周大寨,周毅峰,吴永尧;高活性魔芋葡甘聚糖酶产生菌B23的鉴定及培养条件优化[J];湖北农业科学;2005年04期
2 李剑芳,邬敏辰,夏文水;微生物β-甘露聚糖酶的研究进展[J];江苏食品与发酵;2004年03期
3 唐凌;化学益生素应用现状及发展趋势[J];中国饲料;2003年11期
4 周庆安,刘文刚,邓留坤,闫红军;动物微生态制剂及其应用[J];饲料博览;2003年04期
5 杨参,蔡自建,陈文品;食品工业中常用益生素和化学益生素研究进展[J];粮食与油脂;2003年04期
6 林英庭,李华,刘作功,李文财;益生素在养鸡生产中的应用[J];中国家禽;2003年01期
7 马现永,毕英佐,曹永长;益生素作用机理研究进展[J];广东饲料;2002年06期
8 梁明振,梁贤威,梁坤,文崇利,林宝东,梁斌,黎坚,刘勋;益生素对断奶仔猪生产性能及血清相关指标的影响[J];动物科学与动物医学;2002年12期
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10 那日苏,桂荣,赵青余,成立新;牛用益生素的研究与应用[J];饲料研究;2002年12期
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