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《湖南农业大学》 2007年
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柑橘遗传转化体系的建立及chit42和phyB基因的导入

谢玉明  
【摘要】: 柑橘是世界第一大水果,年产量超过1.1亿吨,中国是柑橘生产大国(面积第一,产量第二)。世界各国都非常重视柑橘的新品种选育,常规方法的选育中种工作一直在开展,并不断获得新的推广品种。但是,由于柑橘自身的一些生物学特性,如实生苗童期长,遗传背景复杂,杂合程度高,具有多胚性等的影响,常规育种常遇到一些障碍,影响育种进程。随着现代生物技术的迅速发展和遗传转化技术的日益完善,将外源基因导入到柑橘中,定向改良现有品种的目标性状,可为柑橘品种改良提供新的途径。 本研究以湖南省主栽柑橘品种及主要砧木品种为研究对象,建立了溆浦甜橙、冰糖橙、辛女椪柑和枳的幼年态材料离体再生体系,以及冰糖橙、纽荷尔脐橙、辛女椪柑成年态节间茎段离体再生体系。采用根癌农杆菌介导的方法,将抗病基因chit42和光敏色素基因phyB导入以上受体材料中,建立了柑橘幼年态和成年态材料的遗传转化体系,获得了一批转化植株,从分子水平、外源基因表达和转化植株生物学特性等方面进行了研究,主要研究结果如下: 1、柑橘幼年态材料离体再生体系的建立 本研究对溆浦甜橙实生苗上胚轴离体再生系统进行系统研究,筛选出适宜的不定芽诱导培养基(MT+3mg/L 6-BA)、不定芽增殖培养基(MT+1.5g/L麦芽提取物+0.5 mg/L 6-BA)和生根培养基(MT+0.5 mg/L IBA)。冰糖橙、辛女椪柑及枳实生苗上胚轴在以上培养基上均能实现高效再生。 2、柑橘幼年态材料遗传转化体系的建立 利用农杆菌介导法把chit42基因转入到溆浦甜橙中,详细研究了实生苗遗传转化体系的影响因素,对比分析外植体年龄、农杆菌侵染时间、共培培养基及pH值、共培养时间、外源目的基因等对转化结果的影响,结果表明,30d苗龄上胚轴切段经农杆菌液侵染20min后,转移到共培养基(MT+3mg/L6-BA)中暗培养3d,再转入筛选培养基(MT+3mg/L6-BA+100 mg/L Kan+500mg/L cef)中进行选择培养,抗性芽诱导率可高达27.8%,抗性芽通过茎尖嫁接可实现植株再生。同时,利用类似方法,把chit42基因转入到冰糖橙和椪柑中;把phyB基因导入溆浦甜橙和枳中,共获得了16个转基因株系,已繁育了235株转化植株。 3、柑橘成年态节间茎段的离体再生及遗传转化体系建立 以纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑的成年态节间茎段为材料,摸索了节间茎段离体再生体系的影响因素,结果表明,适宜于纽荷尔脐橙和冰糖橙节间茎段不定芽再生的培养基为MS+3mg/L 6-BA;辛女椪柑节间茎段不定芽再生相对较困难,适宜其再生的培养基为MS+1mg/LBA+0.5mg/LNAA。 建立了柑橘成年态节间茎段的遗传转化体系,在温室中取半木质化的成年态柑橘枝条,采用改良的预处理灭菌方法F,农杆菌菌液侵染20min,转移到共培养基(MS+1mg/L 2iP+2mg/L IAA+0.5mg/L 2,4-D)上暗培养3d,然后再在筛选培养基(MS+1mg/L BA+30mg/L Kan+500mg/L cef)上进行培养,1个月后获得抗性芽,通过试管茎尖嫁接后获得再生植株。同时,利用类似方法,把chit42基因导入到纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑中,共获得转化植株15株。 4、转phyB基因枳的分子鉴定及生物学特性研究 农杆菌侵染后,共获得27株抗性枳再生植株,通过PCR检测后发现其中有5株扩增出phyB基因的特异目的带;RT-PCR分析表明phyB基因在phyB3,phyB4株系枳基因组中能够表达。 利用Li-6400光合测定仪对转基因枳进行光合特性测定,结果显示转基因枳光合效率强于对照。此外,转化的枳植株在株高、节间长度、叶面积都比对照小,而叶片着生角度明显增宽。 5、转chit42基因柑橘的分子鉴定及抗病鉴定研究 利用PCR、Southern杂交、RT-PCR技术对转chit42基因成年态柠檬和幼年态溆浦甜橙进行了分子检测。PCR和Southern杂交分析认为外源chit42基因已整合到了柠檬和溆浦甜橙基因组中,并且在转基因柠檬SR23株系中为三个拷贝,SR24株系中为双拷贝,在溆浦甜橙中为单拷贝;RT-PCR技术研究表明外源基因能够在柑橘基因组中表达。 对转chit42基因柠檬进行活体和离体抗炭疽病试验,结果表明转基因柠檬抗炭疽病能力得到明显提高。利用半定量RT-PCR技术检测chit42基因在柠檬中的表达,认为在柠檬接种炭疽病菌处理后48 h,chit42基因表达量高于其他处理时间(24、72h)。此外,转基因植株与未转化植株在其形态特征方面无显著差异。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S666

【引证文献】
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1 胡威;张文;黄婷;邓子牛;;利用胚抢救技术获得枸橼杂交后代[A];园艺学文集5[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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10 叶立华;蔡之军;顾掌根;褚伟雄;施木田;;锌对苦瓜不同生育期叶片保护系统的影响[J];安徽农学通报;2007年19期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张文;李燕凌;胡威;将巧巧;周敏;邓子牛;李大志;;利用SRAP标记鉴定枸橼杂交后代[A];园艺学文集5[C];2010年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨守军;根系调控对枣树(冬枣)生长及代谢影响的效应研究[D];山东农业大学;2010年
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3 王延秀;浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究[D];甘肃农业大学;2010年
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10 胡芳;甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D];西北农林科技大学;2010年
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1 张庆福;枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化烟草提高抗脱水研究[D];华中农业大学;2010年
2 张月兴;利用基因芯片解析金柑和纽荷尔应答溃疡病的转录差异[D];华中农业大学;2010年
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7 万小云;脐橙次生果形成机理初探[D];华中农业大学;2010年
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10 王岩;早实枳成花相关基因的表达分析及PtFLC的功能特征[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前9条
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1 马文涛;不同柑橘实生砧木的抗旱性[D];贵州大学;2007年
2 谢让金;柑橘属及其近缘植物基于AFLP分子标记的分类与进化研究[D];西南大学;2008年
【二级引证文献】
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1 杨莉;甜橙和金柑高效安全转基因技术研究[D];湖南农业大学;2012年
【二级参考文献】
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【相似文献】
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2 沈德春 讲述 记者 陈江整理;远教架起致富桥[N];恩施日报;2011年
3 本报通讯员 邓珍辉 覃道武 王燕燕;外销柑橘5000多吨[N];张家界日报;2011年
4 记者 张海滨 通讯员 朱惠刚;五柳村橘农尝到了品种改良的甜头[N];金华日报;2011年
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6 本报记者 刘辉霞;考虑区域布局 发展柑橘良种[N];湖南科技报;2008年
7 记者 胡稳;首届柑橘品鉴会甜蜜举行[N];常德日报;2010年
8 记者刘志强;贵州柑橘品种结构将全面优化[N];科技日报;2002年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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5 范净;柑橘转GFP、AP1和LFY基因植株群体的分子鉴定与基因表达研究[D];华中农业大学;2010年
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7 阮氏雪(NGUYEN THI TUYET);柑橘花粉染色体加倍与越南柑橘三倍体育种的研究[D];南京林业大学;2011年
8 李达旭;几种禾本科牧草遗传转化体系的建立和抗虫转基因研究[D];四川大学;2006年
9 毕毓芳;杨树SnRK基因克隆及遗传转化研究[D];南京林业大学;2009年
10 杨爱国;农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究[D];四川农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李淑艳;农杆菌介导铁载体基因IRT1转化八棱海棠的研究[D];南京农业大学;2008年
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3 彭巍;黑林1号杨转几丁质酶基因的研究[D];东北林业大学;2009年
4 郭琛;柑橘转chit42和phyB基因的研究[D];湖南农业大学;2007年
5 文露清;“Gene Deletor”技术和果实无核基因转化柑橘的初步研究[D];湖南农业大学;2011年
6 尹越;农杆菌介导Ac/Ds基因转化大白菜的研究[D];东北农业大学;2009年
7 吴大强;农杆菌介导sbe Ⅱb基因RNA干涉片段转化玉米自交系的研究[D];安徽农业大学;2008年
8 柳夙宏;用叶圆盘法建立盐芥(Thellungiella halophila)的遗传转化体系[D];山东师范大学;2005年
9 丁淑丽;植物SAMDC基因分子进化分析以及ySAMDC基因转化番茄研究[D];浙江大学;2006年
10 陈敏敏;不结球白菜离体培养再生体系的优化及抗病转基因研究[D];南京农业大学;2007年
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