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《湖南农业大学》 2009年
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病毒载体介导家鸡多能细胞系的转基因技术研究

燕海峰  
【摘要】:为建立家鸡的高效基因转移技术,本文从种蛋开窗技术的改进、用慢病毒表达载体将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染种蛋内囊胚细胞和原生殖细胞、逆转录病毒载体转染睾丸细胞、人促红细胞生成素(hEPO)基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的构建等方面进行了研究,结果如下: 1改进了种蛋开窗工具、开窗方法以及封口方法,使该方法更简单实用,制作效率提高了2倍以上,便于在实践中推广应用,并已申报国家发明专利(申请号CN200710034253.0,公开号CN101020898)。为解决目前因外源基因的随机整合,需要大量实验样本才能使转基因家鸡研究获得成功等问题奠定了基础。 2家鸡种蛋自身含有禽胚胎干细胞(BCs)或原生殖细胞(PGCs)。采用Gateway技术构建了含绿色荧光蛋白(GFP)基因的pLenti6/v5-DEST-GFP慢病毒表达载体,转染体外培养的BCs,获得了约70%的表达效率。转染体内囊胚,孵化13d时,PCR检测阳性率为64.7%。转染血液循环中的PGCs:孵化率为35.0%,在出壳后死亡的3只小鸡肝脏中,GFP基因检出率为100%,其中一只小鸡的眼部能检测到绿色荧光;存活的4只鸡中有3只在12月龄的血液样品中,经PCR检测扩增出了GFP基因片段。 3睾丸生精上皮内含有二倍体的精原干细胞,将这些细胞在体外转染,然后移植入经不育处理的受体公鸡睾丸,使其恢复生精能力并产生转基因精子,是家鸡基因转移的一种新方法。本文构建了含GFP基因的pLG逆转录病毒载体,滴度达到5×10~7 IU/mL,转染了体外培养的睾丸细胞,转染后培养到5 d时,流式细胞仪检测GFP基因的表达率为37.0%,碘化丙锭(PI)染色检测出的细胞活力达99.7%,而且整合的前病毒CpG甲基化程度相当低。转染后的睾丸细胞移植到7只经不育处理的公鸡睾丸,其中2只在2-3个月恢复了生精能力,经PCR扩增证实其产生的精子中含有转基因。 4外源基因仅在输卵管组织中特异表达是家鸡转基因技术所追求的目标。从鸡输卵管基因组DNA中扩增出1.3kb的OV(卵清蛋白)基因5'端调控区,作为家鸡输卵管组织特异性表达启动子。从phEBS-HB质粒扩增出了2.1kb的hEPO(人促红细胞生成素)基因全长DNA片断,作为目的基因。为方便EPO的检测,构建了含hEPO和GFP的共表达载体pOV-GFP-hEPO。通过测序和转染体外培养的家鸡输卵管上皮细胞,证实载体构建正确并能表达。
【学位授予单位】:湖南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S831

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 燕海峰;易康乐;TREFIL P;胡雄贵;邓缘;朱立军;;慢病毒载体导入种蛋内鸡胚技术研究[J];中国生物工程杂志;2012年12期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨鹏华;倪凤娥;李宁;;利用转基因牛生产重组人乳铁蛋白研究[J];安徽农业科学;2008年35期
2 张传生,杜立新;基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建[J];动物学报;2005年04期
3 牟丹蕾;姜泓;王英鹏;李光玉;潘蕾;李新红;王临旭;张岩;黄长形;白雪帆;;用Gateway技术克隆并表达汉滩病毒G1蛋白ITAM样基序[J];第四军医大学学报;2007年15期
4 沈新明,乔贵林,张玲,江培洲,黄华,姚开泰;用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠[J];第一军医大学学报;2002年03期
5 刘吉宏;李峰;郝子悦;李碧春;陈学进;;慢病毒载体法制备转基因动物研究进展[J];动物医学进展;2008年02期
6 张贺;王承利;王洋;;转基因动物研究进展[J];动物医学进展;2008年07期
7 黄利文,韩峰,郑秋君,马学军,陈广南,李玉英,蒋盘宏,吴淑华,侯云德;中国人促红细胞生成素基因组的克隆及其在COS-7细胞中的表达[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1994年02期
8 ;Efficient generation of transgenic chickens using the spermatogonial stem cells in vivo and ex vivo transfection[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年08期
9 李碧春;孙国波;孙怀昌;徐琪;高波;周冠月;赵文明;吴信生;包文斌;余飞;陈国宏;;体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年07期
10 黄淑帧,陈美珏,黄英,张克忠,李华,卢大儒,陆建英,陈云弟,邱信芳,薛京伦,曾溢滔;乳汁中分泌有活性的人凝血因子Ⅸ的转基因羊的研制[J];科学通报;1998年07期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 曹访;宋成义;吴晗;谢飞;陈国宏;王杏龙;;人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建[J];安徽农业科学;2008年09期
2 刘凤军;张玉玲;杨自军;陈兴启;孙达权;王国华;张涌;;体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究[J];安徽农业科学;2008年29期
3 马建;魏益凡;厉志;王丕武;;植物RNA干扰表达载体构建方法的研究[J];安徽农业科学;2009年18期
4 张玉玲;张晶晶;刘凤军;张涌;;转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的体外诱导表达[J];安徽农业科学;2009年32期
5 张昱;王燕;杨帆;蔡亚非;王根林;;携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定[J];安徽师范大学学报(自然科学版);2010年03期
6 康永刚;廖云琼;;动物遗传繁育进展综述[J];现代农业科技;2008年08期
7 代长云;黄海军;向敏;陶弼菲;陈志华;高其双;吴建英;钱运国;;动物乳腺生物反应器研究进展[J];现代农业科技;2010年04期
8 谢畅;于明举;惠楠;王岭斌;李文杰;赵永聚;;通过睾丸内注射转染外源DNA在小鼠精子的表达[J];动物学杂志;2010年02期
9 王伟;施恒亮;付春玲;曹让娟;朱筱娟;;慢病毒介导的酸性成纤维细胞生长因子基因在乳腺癌细胞MCF-7中的表达及其意义[J];吉林大学学报(医学版);2012年01期
10 韩爱云,黄仁录,李建国;分子生物学技术在反刍动物营养中的应用[J];黄牛杂志;2005年04期
中国重要会议论文全文数据库 前4条
1 王治国;袁耀明;;乳腺上皮细胞体外培养的研究进展[A];第三届中国奶牛发展大会论文集[C];2008年
2 李裕强;张涌;;我国动物胚胎工程技术的产业化战略分析[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 张冰;王潇;张居农;;转基因克隆技术在羊上应用的研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
4 李海燕;韩萍;穆楠;;动物转基因技术在牛育种中的应用[A];第三届中国牛业发展大会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张艳丽;转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D];南京农业大学;2010年
2 Hubdar Ali Kaler;鸡输卵管特异性表达tPA和leptin的研究[D];南京农业大学;2011年
3 王宁;精原干细胞途径建立hFIX转基因小鼠及Flt3配基乳腺生物反应器研究[D];复旦大学;2003年
4 龙章富;牛蛙生长激素基因克隆及其表达效应研究[D];四川大学;2003年
5 雷安民;山羊-牛异种细胞核移植研究[D];西北农林科技大学;2004年
6 于舒洋;具有天然生物活性的重组人HFRS抗体在转基因小鼠乳腺中的表达[D];中国农业大学;2005年
7 高波;表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究[D];扬州大学;2005年
8 张传生;鸡X期胚盘细胞体外培养与输卵管生物反应器的研制[D];山东农业大学;2005年
9 郑月茂;转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D];西北农林科技大学;2005年
10 赵晓娥;转人t-PA指形区缺失突变体基因山羊体细胞核移植研究[D];西北农林科技大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张帆;dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究[D];华中农业大学;2010年
2 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
3 向安静;杜洛克×二花脸F2资源群体构建及其血液指标、免疫性状的测定和分析[D];华中农业大学;2010年
4 刘远;基于基因聚合策略选育高产仔数大白猪新品系的研究[D];华中农业大学;2010年
5 崔凯;精子载体法制备FecB转基因太行山羊技术的研究[D];河北农业大学;2011年
6 孙英民;慢病毒载体制备转基因鸡技术平台的建立[D];河北农业大学;2011年
7 肖红;小鼠四倍体补偿技术的初步探讨[D];内蒙古大学;2011年
8 孙丹;绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除的初步研究[D];辽宁师范大学;2011年
9 杜雪;嗜热菌糖苷酶基因LacS牛乳腺特异性表达载体的构建、转染及鉴定[D];内蒙古农业大学;2011年
10 王小丹;转基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白食用安全性和功能研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 崔奎青;刘庆友;赵一广;王晓丽;钟俊洁;熊建明;李爱友;黄钦华;;慢病毒法生产转基因鸡的初步研究[J];安徽农业科学;2012年19期
2 燕海峰;文平;邓缘;胡雄贵;P.Trefil;柳小春;;种蛋开窗技术及其对鸡胚发育影响的研究[J];激光生物学报;2008年06期
3 徐世永;丁红梅;孙岩;王蒙;蔡亚飞;刘红林;;慢病毒载体介导外源基因在不同细胞及鸡体不同组织中的表达[J];南京农业大学学报;2008年03期
4 胡雄贵;肖定福;邓缘;燕海峰;;利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达[J];生物技术;2007年04期
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 陈志胜;黄晓敏;廖敬森;;慢病毒的包装及其对禽细胞的转基因效率研究[J];动物医学进展;2013年12期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杜立新,尹春光;鸡Ⅹ期胚盘细胞体外培养[J];动物学报;2002年04期
2 安静,杜立新;鸡胚胎干细胞的分离、培养和鉴定[J];动物学报;2003年05期
3 秦洁,李碧春,陈国宏,蔡琳琳,韩威,周冠月,吴洪,孙思宇;鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代[J];动物学报;2005年04期
4 赵英会,杜立新,张念华;用逆转录病毒法制作鸡输卵管生物反应器的研究[J];山东家禽;2001年03期
5 岳奎忠,于元松,周佳勃,李子义,孙兴参,曹允考,谭景和;改进山羊超数排卵方法的研究[J];东北农业大学学报;2000年01期
6 王平忠,白雪帆,张颖,黄长形,李光玉;HFRS患者汉滩病毒特异性CTL克隆靶细胞的建立及意义[J];第四军医大学学报;2004年07期
7 靖学芳;转基因动物在免疫学研究中的应用[J];动物医学进展;2004年04期
8 张克忠,崇松,陈立,卢大儒,薛京伦,邱信芳;人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究[J];复旦学报(自然科学版);1998年04期
9 金礼春,张豪一,曹伟丽;转铁蛋白放射免疫分析方法的建立[J];放射免疫学杂志;2002年02期
10 杨美英;贺红霞;王艳;高倩倩;付雷;朱筱娟;;番茄茄红素β-环化酶基因高效沉默载体构建[J];分子植物育种;2007年01期
【相似文献】
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1 金人一;;美Amgen公司改变转基因动物工作重点[J];生物技术通报;1989年09期
2 卢一凡;邓继先;肖成祖;马清钧;王冬平;;转基因动物理论与技术的研究进展[J];生物技术通报;1997年04期
3 李莲,李跃民;转基因动物研究进展[J];草食家畜;1999年04期
4 孙玉江,王丽,李兰,潘庆杰;精子整合外源DNA的分子机制与转基因动物的制备[J];中国农业科技导报;2005年04期
5 张吉清,朱明霞;转基因动物生物反应器的研究进展[J];畜牧兽医科技信息;2005年09期
6 谭碧君;;转基因动物中慢病毒载体包装的优化[J];上海畜牧兽医通讯;2008年02期
7 ;我国首例人治疗性抗体转基因奶牛诞生[J];中国科技信息;2008年18期
8 王璋瑜;;DNX宣布微注射专利权引起不满[J];生物技术通报;1990年06期
9 李思经;;转基因动物即将在奶里产生药用蛋白[J];生物技术通报;1992年03期
10 ;关于召开“全国首届转基因动物学术讨论会”的通知(第一轮)[J];生物技术通报;1993年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 赵彦青;纪香;赵宝成;;转基因动物的研究与应用及其存在问题[A];“科技进步推进畜牧业现代化”科技论文集[C];2011年
2 朱振营;林祥梅;刘建;吴绍强;仇松寅;王建武;薛振华;;多重PCR检测转基因奶牛方法的建立[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
3 成国祥;;转基因动物安全性思考[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年
4 岳秉飞;张业彬;李保文;刘双环;邢瑞昌;;转基因用小鼠胚胎库的建立及应用[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
5 罗克;;转基因动物的原理技术应用与问题[A];畜牧兽医事业的发展和人类健康——21世纪畜牧兽医生产和科学技术论坛会文集[C];1999年
6 朱孟芝;董雅娟;宋少康;牛召珊;柏学进;;干细胞在生产转基因动物以及在畜牧生产中的应用前景[A];2010中国牛业进展[C];2010年
7 周莉;李岩;高虹;何君;;转基因动物在毒理学中的应用[A];2007年全国药物毒理学会议论文集[C];2007年
8 王倩;胥保华;;蜜蜂卵显微注射转基因技术研究进展[A];2008年全国蜂产品市场信息交流会暨中国(郑州)蜂业博览会论文集[C];2008年
9 张冰;王潇;张居农;;转基因克隆技术在羊上应用的研究进展[A];2010中国羊业进展[C];2010年
10 张冰;王潇;张居农;;转基因克隆技术在羊上应用的研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 刘霞;由转基因动物生产的药物首次在美上市[N];科技日报;2009年
2 李荔;牛昱宇:转基因猕猴培育成功[N];北京科技报;2010年
3 实习生 周英;转基因如何从小鼠到人类?[N];科技日报;2010年
4 记者 熊燕;国内首例转基因猕猴在滇培育成功[N];云南日报;2010年
5 刘征;英国专家呼吁加强转基因动物管理[N];农民日报;2002年
6 本报记者 徐虹;转基因动物有害吗?[N];四川日报;2000年
7 记者 张可喜;日本科学家培育出转基因动物[N];新华每日电讯;2000年
8 丁香 译;首个转基因动物药物获准上市[N];中国医药报;2009年
9 吴洣麓;转基因动物将成人类天然药厂?[N];北京科技报;2006年
10 记者 王翰林;我国转基因动物乳腺反应器研究获突破[N];科技日报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 房义;转基因羊生殖安全评价的研究[D];中国农业大学;2014年
2 吴易雄;转基因动物的伦理问题和公共政策研究[D];中南大学;2008年
3 李峰;精子介导的人凝血因子Ⅸ转基因绵羊技术研究[D];复旦大学;2005年
4 曹阳;人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备[D];大连理工大学;2003年
5 吴淑云;腺病毒介导重组人生长激素基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究[D];西北农林科技大学;2009年
6 叶华虎;利用精子载体方法研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因羊乳腺生物反应器[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
7 李汇华;人载脂蛋白AI转基因小鼠抗实验性动脉粥样硬化的分子病理学研究[D];中国协和医科大学;1998年
8 赵永聚;精子因素对精子载体法制备转基因山羊影响的研究[D];第三军医大学;2005年
9 陆利;骨髓间充质干细胞、银杏提取物及电针治疗多发性硬化的机理探讨[D];北京中医药大学;2007年
10 帅怡;金属硫蛋白抗阿霉素心脏毒性作用的基因组学与蛋白质组学研究[D];四川大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 蒙霞;论生命伦理学视野中转基因技术的研究与应用[D];广西大学;2004年
2 谢水林;可视化胰蛋白酶原Ⅱ外分泌功能转基因小鼠的制备研究[D];第一军医大学;2005年
3 谭碧君;囊胚细胞为媒体转基因鸡的技术研究[D];湖南农业大学;2006年
4 武珅;sfat-1真核表达载体构建及其转基因细胞系建立[D];中国农业科学院;2008年
5 陶玉慧;神经前体细胞在成年小鼠脊髓的分布特征[D];南昌大学;2008年
6 王丽莉;基因转染精原干细胞在受体微环境中的增殖与分化[D];首都师范大学;2008年
7 冯昌波;转基因动物专利研究[D];中国政法大学;2011年
8 马孝彦;转基因动物食品问题的伦理审视[D];南华大学;2011年
9 高宏珍;转基因技术的伦理突显与解困研究[D];太原科技大学;2014年
10 许文兵;转基因克隆牛胚胎的玻璃化冷冻[D];西北农林科技大学;2012年
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