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《湖南农业大学》 2010年
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皱边石杉内生真菌ISSR分子标记研究

高思青  
【摘要】: 石杉科植物中的关键药理成分石杉碱甲是对阿尔茨海默病有特殊疗效的临床用药,但在石杉科植物体内含量极少,蛇足石杉是目前作为石杉碱甲的主要来源,但其含量也仅在0.006%-0.120%之间,且石杉科植物生长缓慢,生长环境条件要求苛刻,因大量采集,蛇足石杉已处于濒临灭绝。本课题组前期进行皱边石杉的组织培养,发现其有内生真菌的存在,故尝试从皱边石杉内生真菌中分离得到能产生石杉碱甲代谢产物的菌株,试图从微生物发酵途径来解决石杉碱甲来源局限的问题。本课题组前期已完成对皱边石杉内生真菌的分离、纯化,得到了100株内生菌,其中99株为内生真菌,1株为细菌,并对1株能产四草酸钾的内生真菌进行了发酵培养优化条件研究;对分离纯化的内生真菌进行了初步的形态学鉴定,在此基础上,利用ISSR-PCR技术对其进行亲缘关系研究,准确归类。为后期研究开发亲缘关系相近的功能菌种,提供一张遗传分化图谱。期望后期研究可从皱边石杉中筛选获得产Hup A或其他功能成分的菌株,开拓Hup A的新资源。这不仅对皱边石杉内生菌的开发和利用有积极意义,也可以为石杉属植物的内生真菌研究提供理论参考。 本论文第一部分研究了皱边石杉内生真菌菌丝体DNA提取的有效方法。改良CTAB法和氯化苄法对皱边石杉内生真菌菌丝体的DNA提取效果,发现改良CTAB法提取皱边石杉内生真菌DNA适合于菌丝体细长,生长速度快、质地疏松的菌种;而氯化苄法可提取所有菌丝体DNA,适应范围更广。对提取的DNA进行DNA储藏稳定性研究,发现皱边石杉内生真菌DNA即使保存在TE缓冲液中,经过几次反复冻融,亦有明显的降解,所以在试验中应该对DNA样本分管保存,以防发生样本降解导致后续试验无法完成。DNA的样本是否纯化,可根据后续试验的要求进行处理,若后续后续试验对DNA样本纯度要求不高,可不进行纯化,以防样本在纯化过程中的损耗。 第二部分研究了皱边石杉内生真菌的ISSR分子标记。合成了100条ISSR引物进行筛选,筛出41条引物能对皱边石杉内生真菌菌丝体DNA进行有效扩增,设置不同温度梯度,摸索出了各条引物的最佳退火温度。通过单因素实验法和正交试验法相结合的方法,优化了ISSR-PCR反应体系中的DNA模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量,建立了皱边石杉内生真菌ISSR-PCR最佳反应体系。最佳皱边石杉内生真菌ISSR-PCR反应体系为:25 u L反应体系中含有DNA模板为30 ng, Mg2+终浓度2.0 mmol/L, Taq酶用量1.5 U, dNTPs终浓度为0.6 mmol/L以及引物(100 pmol/L) 2μL和10×PCR Buffer 2.5μL。由于皱边石杉内生真菌种类丰富,所探索的真菌DNA提取方法、ISSR引物、ISSR-PCR反应条件对大多数真菌都有一定的适用性,对真菌的ISSR分子标记的研究提供的一定的参考。 已优化的ISSR-PCR反应体系,从可扩增的41条引物中筛出10条引物,其ISSR-PCR扩增条带丰富、清晰。作为皱边石杉所有内生真菌菌丝体DNA ISSR-PCR扩增的特定引物。以这10条引物对皱边石杉植物的DNA样本进行了ISSR-PCR扩增,以这10条引物,共扩增出了3975条ISSR条带,其中多态性条带带3975条,占100%,平均每条引物产生ISSR条带397.5条。采用Ntsys-PC软件分构建了99株皱边石杉内生真菌间的遗传距离矩阵(D),对数据进行聚类分析,构建出了他们的分子系统树。99株内生菌之间的遗传距离在0.9992-0.0429之间。利用POPGENE 32软件计算ISSR扩增产物的多态性比例(P)为100%, Nei's基因多样性(H)平均为0.2804, Shannon's信息指数(Ⅰ)为0.4392,说明皱边石杉内生真菌种类和遗传基础丰富。 对分子系统树分析发现所有菌种可大致分为15个类群,99株皱边石杉内生真菌之间相似性较低,9对真菌的相似性系数较高,说明真菌在形态学特征上相似时并不能完全确定为同一个种或一属,形态学鉴定只能作为菌种鉴定的一个参考,更准确的鉴定应该通过分子标记等手段。 第三部分应用ISSR分子标记对皱边石杉植物体与内生真菌之间的关系进行了初步探讨,结果显示皱边石杉植物DNA样本在探索出的皱边石杉内生真菌ISSR-PCR体系下用选择的10条引物扩增有5条引物可扩展出条带,相应的也能在皱边石杉内生真菌各引物PCR产物中找到与植物体DNA样本ISSR-PCR扩增产物相同的条带,预示着可能皱边石杉植物体与皱边石杉内生真菌之间存在着相似的基因片段,可以进一步对此进行研究和验证,加快筛选出具有相似功能基因片段的皱边石杉内真菌。 本研究通过ISSR分子标记对皱边石杉内生真菌进行了系统的亲缘归类,并揭示皱边石杉各内生真菌之间的联系及内生真菌与植物的关系,初步确定了后续内生真菌进行发酵研究的选择对象,对发酵产物进行检测,以期找到功能微生物。还可从分子生物学方向入手,设计适合于皱边石杉内生真菌和皱边石杉植物体的特异引物,建立最优的PCR反应体系,对内生菌和植物体进行PCR扩增,找到相同的功能基因片段从而找到与植物体产生相同物质的功能微生物。
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