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《中南林业科技大学》 2009年
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篦子三尖杉的组织培养及生物碱检测

邹露  
【摘要】:篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast.)是一种古老孑遗植物,它的叶、枝、种子、根可提取多种植物碱,对治疗白血病和淋巴肉瘤等有一定的疗效,同时又是材用和园林绿化用的优良树种。随着篦子三尖杉的开发利用及其潜在价值的发现,篦子三尖杉的快速繁殖越来越显示出它的重要意义。但到目前为止,篦子三尖杉的组织培养在国内外开展极少,更未在生产上推广应用。本研究运用植物细胞培养技术,分别对篦子三尖杉愈伤组织的诱导,愈伤组织培养体系和悬浮细胞培养体系的建立及其高三尖杉酯碱代谢的调控等方面的研究。主要研究结果如下: (1)湖南地区三种三尖杉(普通三尖杉、篦子三尖杉、粗榧)叶片中高三尖杉酯碱的含量高低为:篦子三尖杉粗榧普通三尖杉。 (2)篦子三尖杉愈伤组织较容易诱导,各种培养基很大范围内都可以产生愈伤组织。其中最佳愈伤组织诱导培养基为:MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1KT。篦子三尖杉外植体取材应选择在3-5月间的嫩叶叶基,其愈伤组织诱导率最高达100%,且外植体的污染率低。 (3)在愈伤组织的继代培养中,以愈伤组织诱导培养基为基础,研究了蔗糖浓度、愈伤组织接种量、培养基pH值和植物激素对三尖杉愈伤组织生长的影响。结果表明,以培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1KT,蔗糖30g·L-1,接种量2.0g·40mL-1,pH值为5.8的条件下,愈伤组织增值效果最好。研究了愈伤组织培养中培养条件及天然有机营养物质对高三尖杉酯碱代谢的影响。试验结果显示:添加蛋白胨0.1g·L-1时,愈伤组织鲜重增长率最高达到556.44%,但高三尖杉酯碱含量低,而水解酪蛋白为0.1g·L-1时不仅愈伤组织干重增长率提高到330.62%,而且高三尖杉酯碱的含量也提高到16.8μg·g-1 (4)在悬浮细胞培养中,蔗糖浓度低于30 g·L-1时有利于细胞生长;摇床转速为80 r·min-1,pH为5.8的培养条件有利细胞生长;高的接种量(2.0g·30m1-1)有利于细胞生物量合成;以培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1KT,添加蔗糖30g·L-1,每30~35d继代一次,成功地建立了篦子三尖杉悬浮细胞培养体系,细胞增长率达到852.93%。 (5)研究了培养条件、高三尖杉酯碱代谢前体对高三尖杉酯碱代谢的影响。结果表明培养基起始pH值为6.2时,高三尖杉酯碱的代谢量最高;添加酪氨酸0.1mg·L-1+苯丙氨酸0.5 mg·L-1的代谢前体能显著提高高三尖杉酯碱的代谢,高三尖杉酯碱的含量比对照提高了77%,为8.5μg·g-1 (6)篦子三尖杉固体培养和液体培养愈伤组织中高三尖杉酯碱的检测:对比了篦子三尖杉固体培养的愈伤组织和篦子三尖杉悬浮培养的愈伤组织中高三尖杉酯碱的含量。用HPLC进行定量分析,发现后者的高三尖杉酯碱含量明显高于前者。
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