收藏本站
《中南林业科技大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

油茶种子成熟调控蛋白基因的分离克隆及功能研究

包梅荣  
【摘要】:油茶(Camellia oleifera),又名茶籽树、油茶树,属山茶科山茶属,多年生常绿小乔木或大灌木,是原产中国的乡土树种,与油橄榄、油棕和椰子并称为世界四大木本油料树种,在世界上也惟有中国有大面积的栽培。它是我国南方重要的木本油料树种,其种子富含油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸,营养价值较高,是一种优质、保健食用植物油。油茶为花果同期,从开花到种子成熟,大约需要一年的时间,油茶种子成熟的好坏直接影响着油茶的品质和产量。油茶树生命周期长,仅仅采用传统育种方法和技术很难满足当前油茶生产化需求的优良品种的要求,因此,结合基因工程育种方法和技术来培育油茶早果、早熟优良品种,是油茶产业化发展的一个必要途径。本研究通过交错延伸PCR扩增技术,获得了油茶种子成熟调控蛋白基因(Camellia oleifera ripening regulated protein gene, CoRrp gene)的全长cDNA序列和基因组的全长DNA序列;利用半定量RT-PCR方法研究了油茶种子成熟蛋白基因在油茶各组织和不同发育期种子中的表达模式;构建了超量表达载体和siRNA表达载体并转化到野生型拟南芥植株中,研究了CoRrp基因的功能。主要研究结果如下: 1.油茶种子成熟调控蛋白基因(CoRrp gene) cDNA序列的克隆 以油茶cDNA文库和EST文库为基础,分离克隆了一条油茶种子成熟调控蛋白基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为966bp,开放阅读框含有702 bp的核苷,编码233个氨基酸的亲水多肽。生物信息学分析表明:该基因的分子量为25267.46 Da,等电点(PI)为4.43,翻译的氨基酸序列具有与番茄和马铃薯成熟调控蛋白相同的D-片段DDDDDDDVD序列和E-片段EETEAEE序列特征,该肽链中极性氨基酸比率占53.16%,其中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等酸性氨基酸含量比较高,是一个半膜结合结构域,非分泌性蛋白。蛋白质高级结构中以α螺旋为主要结构元件,不规则卷曲则散布于整个蛋白质中。 2.油茶种子成熟调控蛋白基因的基因组DNA全长扩增 通过交错延伸PCR扩增技术获得了油茶种子成熟调控蛋白基因的基因组的全长DNA序列,该基因含有1个内含子,其长度为139 bp,分析该基因内含子序列发现:A+T碱基组成为69.78%,G+C碱基组成为30.22%,属于GT-AG型内含子,序列中存在一个类似于启动子(TATAA))框结构。该基因的内含子中具有真核mRNA内含子结构特征序列的5'剪接位点具有AG/GTAAGT保守序列和3'剪接位点具有TGCAG/G的保守序列。真核mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。因此,油茶种子成熟调控蛋白基因内含子的扩增为该基因的下一步超量表达研究奠定了基础。 3.油茶种子成熟调控蛋白基因在油茶各组织和不同发育期种子中的表达模式 利用半定量RT-PCR方法研究了油茶种子成熟蛋白基因在油茶根、茎、叶、花、芽和不同发育期油茶种子中的表达模式,结果显示油茶CoRrp基因的表达具有空间上的特异性,主要是在种子中表达,而在根、茎、叶中不表达。从种子的发育时期来看,CoRrp基因的表达又具有时间上的特异性,它在最早分化出来的胚中表达量较少,随着种子的发育成熟,CoRrp基因的表达水平逐渐升高,种子成熟时,CoRrp基因的表达量达到最高值。由此看出,油茶种子成熟调控蛋白基因在种子成熟过程中起着重要的作用。 4.超量表达载体和小干扰RNA表达载体的构建及转基因植株的获得 以拟南芥AT2G18110基因的CDS序列及油茶CoRrp基因的保守序列为基础,按照Tuschl设计原则,设计了小干扰RNA序列,并把它构建到中间载体pCAMBIA1304-35S中,获得了小干扰RNA表达载体pCAMBIA1304-siRNA;本研究还利用CoRrp基因基因组DNA全长序列,将CoRrp的含有内含子的完整DNA序列克隆到中间载体pCAMBIA1304-35S的CaMV 35S启动子下方的MCS中,构建了超量表达载体pCAMBIA1304-CoRrp。将构建好的超量表达载体pCAMBIA1304-CoRrp和小干扰RNA表达载体pCAMBIA1304-siRNA,用农杆菌介导Floral Dip法转化到野生型拟南芥中,获得了43株转pCAMBIA1304-CoRrp的T2代拟南芥和31株转pCAMBIA1304-siRNA的T2代拟南芥。 5.超量表达转基因拟南芥和RNA干扰表达转基因拟南芥中目的基因的表达研究 利用半定量RT-PCR检测转基因拟南芥和野生型拟南芥中(CoRrp基因的表达量,结果表明,转基因拟南芥中CoRrp的表达水平与野生型有明显差异,所挑选的12株超量表达转基因植株中CoRrp的表达水平都比野生型拟南芥中的要高;所挑选的12株干扰表达转基因植株中CoRrp的表达水平比野生型拟南芥中的表达要低,与野生型拟南芥中CoRrp的表达量和内参基因Actin的表达量相比较,10株转pCAMBIA1304-siRNA拟南芥的CoRrp的表达量只有对照的50%。 6. CoRrp在过量表达转基因拟南芥与RNA干扰表达转基因拟南芥中种子成熟调控 对超量表达转基因拟南芥与RNA干扰表达转基因拟南芥的表型观察研究发现,超量表达转基因拟南芥和RNA干扰表达转基因拟南芥与野生型拟南芥在营养生长阶段没有很大的区别,但进入生殖生长阶段时,多数超量表达转基因拟南芥的种子提前成熟,成熟度较高种子比较饱满;多数RNA干扰表达转基因拟南芥的种子推迟成熟,成熟度较低。依据统计分析结果,过量表达的T2代拟南芥中55.8%表现为种子提前成熟3-4d;RNA干扰表达的T2代拟南芥中64.5%表现为种子推迟成熟4-5d。这表明油茶CoRrp基因在种子成熟过程中具有成熟调控功能。 油茶种子成熟调控蛋白基因的表达模式及其功能研究,将为油茶的分子育种和培育早果早熟油茶新品种奠定物质和技术基础,具有重要的参考意义和应用价值。种子成熟期的提前,缩短了生长周期,也为其它科研成果在油茶上能够得到迅速应用奠定了基础。
【学位授予单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S794.4

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 万小荣;李玲;;植物ACC合成酶的分子生物学[J];安徽农业科学;2007年03期
2 雷东锋,李剑君,张宴,白西元,王晨,赵文明;果实成熟过程相关调控基因研究进展[J];西北植物学报;2000年01期
3 张晓娟;张林生;杨颖;;水分胁迫下小麦类脱水素基因表达的半定量RT-PCR分析[J];西北植物学报;2007年11期
4 洪燕萍,陈春玲,赖钟雄;基因工程在果实延熟中的应用[J];福建果树;2000年01期
5 张云,黄儒珠,刘大林,齐清琳,刘国敏,叶锋;油茶随机扩增多态DNA条件的研究[J];福建林业科技;2003年02期
6 王荣;李红菊;;半定量RT-PCR法在检测基因表达水平中的应用[J];阜阳师范学院学报(自然科学版);2007年01期
7 刘中成,赵锦,刘孟军;mRNA差异显示技术评述[J];分子植物育种;2004年06期
8 秦柳华;;桂林地区油茶农家良种——葡萄油茶的优良性状及其发展前景[J];广西林业科技资料;1980年02期
9 张海洋,卫双玲,卫文星,张体德,路凤银,丁法元;芝麻同源四倍体的诱发与鉴定[J];华北农学报;2001年02期
10 谭晓风,陈永忠;油茶分子育种的重点和策略[J];湖南林业科技;2004年06期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 石明旺;油茶种子EST文库构建及油脂合成关键酶基因的分离鉴定[D];中南林学院;2004年
2 叶锐;水稻种子发育相关转录因子的分离和功能研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 贺晶;山茶属红山茶组植物RAPD分类研究[D];中南林学院;2001年
2 张云;油茶遗传多样性及遗传性状的RAPD分析[D];福建师范大学;2003年
3 仇键;油茶种子油体蛋白基因的分离克隆及其原核表达[D];中南林业科技大学;2006年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 方志军;金桂芳;倪大鹏;武元和;李元征;;小麦高分子量谷蛋白亚基的研究进展及其与面包主要烘烤品质指标间的关系[J];山东农业科学;2007年05期
2 孙爱清;万勇善;刘凤珍;张昆;秦兴国;;干旱胁迫对不同花生品种光合特性和产量的影响[J];山东农业科学;2010年10期
3 吴艳艳;魏绍冲;张静;苏秀伟;;甜樱桃乙烯转录因子PaEIL1基因的克隆及序列分析[J];山东农业科学;2011年04期
4 陈聪;江昌俊;叶爱华;谭振;童鑫;;茶树PCP基因内含子的克隆与序列分析[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年11期
5 杨光道;;油茶品种对炭疽病酶活性的生理生化抗性研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年09期
6 徐田;张林涛;陈福;贾代顺;郎南军;;试论我国油茶发展现状及对策[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年09期
7 万小荣;李玲;;植物ACC合成酶的分子生物学[J];安徽农业科学;2007年03期
8 王建平;柴立和;;蛋白质分子网络的分形结构[J];安徽农业科学;2007年06期
9 程剑;陈长庚;王文杰;罗仲兴;吴新荣;张必桦;徐奕鼎;;安徽省祁门县油茶品种资源及其利用研究[J];安徽农业科学;2008年34期
10 谢善高;郑小贤;刘洪;莫大旺;吴艺梅;;不同采脂方法对马尾松产脂量的影响[J];安徽农业科学;2009年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐红霞;陈俊伟;;枇杷果实DHN基因克隆及其在低温胁迫下的表达分析[A];第五届全国枇杷学术研讨会论文(摘要)集[C];2011年
2 管蕊;沈中元;唐旭东;徐莉;朱峰;陶恒平;陈大睿;;感染BmNPV家蚕中肠组织cDNA文库的构建[A];中国蚕学会商品性小蚕饲养规程和蚕病防控学术研讨会论文集[C];2010年
3 庄绪静;曹雅忠;李克斌;尹姣;;同源建模和分子对接方法的应用与发展[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 曾兴权;吉万全;;西藏普通小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基组成及遗传多样性分析[A];中国作物学会2007年学术年会论文集[C];2007年
5 杜健;冯浩;吴普特;张月丽;黄文敏;陈军;高朝;王炳荣;朱守勇;曹超;;棉花生理抗旱与农艺节水技术耦合对产量的影响[A];中国作物学会2007年学术年会论文集[C];2007年
6 李平;王成章;严学兵;郭玉霞;史莹华;;两种策略分别克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因[A];中国草学会饲料生产专业委员会第十六次学术研讨会论文集[C];2011年
7 刘文革;王鸣;;植物同源多倍体遗传变异的研究[A];中国园艺学会第六届青年学术讨论会论文集[C];2004年
8 王学凤;蔡明;贺丹;任翔翔;王晓玉;潘会堂;张启翔;;紫薇2n配子诱导研究初报[A];中国观赏园艺研究进展(2010)[C];2010年
9 李卫华;张天真;;棉花转基因抗虫研究的进展、问题与展望[A];中国棉花学会2008年年会论文汇编[C];2008年
10 唐掌雄;刘志芳;龚胤昕;;离子辐射育种研究进展[A];中国原子能农学会第七次代表大会暨学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王冰;降解丝素放线菌的分离鉴定、发酵条件优化及其降解机制研究[D];山东农业大学;2009年
2 成广雷;国内外种子科学与产业发展比较研究[D];山东农业大学;2009年
3 李惠华;龙眼体胚发生过程中激素代谢和信号转导相关基因的克隆与表达[D];福建农林大学;2010年
4 张妙霞;野生香蕉(Musa spp., AB group)抗寒相关基因的克隆与表达分析[D];福建农林大学;2010年
5 程敬丽;源自内生真菌的倍半萜类新颖高效抑菌化合物的衍生合成与生物活性研究[D];浙江大学;2010年
6 郭荆哲;反义GNOM诱导表达系统短时调控生长素分布对拟南芥胚胎发生和根发育的影响[D];武汉大学;2010年
7 陈欣;蛋白质在不同界面的识别、吸附及稳定性研究[D];浙江大学;2009年
8 王晓飞;水稻不定根发育调控基因OsDARE1克隆和功能研究[D];浙江大学;2010年
9 胡芳;甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D];西北农林科技大学;2010年
10 曾兴权;小麦抗条锈病种质的鉴定及其抗性相关基因的差异表达和克隆[D];西北农林科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李良;湖北省油茶优良单株遗传多样性及品质初步分析[D];华中农业大学;2010年
2 王威浩;油茶FatB基因的全长cDNA克隆[D];中南林业科技大学;2009年
3 李魏;油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的全长cDNA克隆[D];中南林业科技大学;2009年
4 张艳萍;蛋白质序列的数学描述及其应用[D];浙江理工大学;2010年
5 张伟;分子光谱法研究蛋白质与小分子的相互作用及其分析方法研究[D];郑州大学;2010年
6 史舵;基于主成分分析方法的蛋白质亚细胞定位[D];大连理工大学;2010年
7 兰任;基于并行混合粒子群算法的蛋白质结构预测[D];大连理工大学;2010年
8 于壮;CMO启动子驱动CMO基因在烟草中的表达[D];辽宁师范大学;2010年
9 张菲菲;重组甜蛋白Brazzein和MBLⅡ基因植物表达载体构建及人参果再生体系的建立[D];甘肃农业大学;2010年
10 周秦;山核桃果实成熟期间基因表达的初步分析[D];浙江农林大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李东林,张良富,周良骝,李良松;关于发展我省油茶生产的战略思考(上)[J];安徽科技;2000年02期
2 李良松,李东林,张良富,周良骝;关于发展我省油茶生产的战略思考(下)[J];安徽科技;2000年03期
3 韩春春;王继文;魏守海;;乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的结构与功能[J];安徽农业科学;2006年03期
4 江昌俊;欧洲油菜花粉cDNA文库的构建[J];安徽农业科学;1995年03期
5 高健,许晓风,乌慧玲,陈学平,周家昊;特异种质烟草全长cDNA文库的构建及质量分析[J];安徽农业大学学报;2004年01期
6 汪永庆,徐来祥,张知彬;RAPD技术的标准化问题[J];动物学杂志;2000年04期
7 廖靖军,安成才,吴思,陈章良;查尔酮合酶基因在植物防御反应中的调控作用[J];北京大学学报(自然科学版);2000年04期
8 裴凌鹏,李伟,黄勤妮;EST在植物代谢研究中的应用[J];北京联合大学学报(自然科学版);2003年03期
9 罗忠泽;金花茶及其远缘杂种末成熟胚离体培养的初步研究[J];北京林业大学学报;1986年04期
10 李凤兰,张志毅,张民侠;白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(Ⅲ)──加倍体某些形态特征的观察[J];北京林业大学学报;1994年02期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 卫增泉;颉红梅;周光明;郝冀芳;李文建;李兴林;冯岩;;重离子束在植物开发中的应用[A];西部地区第二届植物科学与开发学术讨论会论文摘要集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 刘昱辉;植物油体表达体系的建立及Profilin2维管束特异表达启动子的区段缺失分析[D];中国农业科学院;2001年
2 张智俊;油茶优良无性系组织培养、RAPD分子鉴别和cDNA文库构建的研究[D];中南林学院;2003年
3 张今今;中国葡萄属野生种抗白粉病基因cDNA克隆及序列分析[D];西北农林科技大学;2003年
4 石明旺;油茶种子EST文库构建及油脂合成关键酶基因的分离鉴定[D];中南林学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 眭顺照;油菜Oleosin基因克隆及其与GUS基因融合子表达载体的构建[D];西南农业大学;2003年
2 张云;油茶遗传多样性及遗传性状的RAPD分析[D];福建师范大学;2003年
3 闫红飞;小麦叶锈菌与Lr38互作诱导抗病基因表达DDRT-PCR分析[D];河北农业大学;2003年
4 陈义挺;楷杷种质资源的RAPD分析[D];福建农林大学;2005年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘晓庚,夏红英;油茶果及其副产品的氨基酸分析[J];林产化学与工业;1997年01期
2 李家友;油茶果采摘有讲究[J];湖南林业;2003年10期
3 ;油茶果开发价值高[J];农村实用技术;2001年05期
4 池国富;;油茶采摘何时宜[J];农村百事通;2006年21期
5 周定华,周刊;油茶果“寒露”后采摘为宜 红薯在“立冬”边收挖适时[J];湖南农业;1994年10期
6 景人;油茶果开发价值高[J];农村新技术;1998年02期
7 龚发;油茶果综合开发价值高[J];农村实用技术;2000年03期
8 ;油茶果的综合利用[J];中国农业信息;2004年02期
9 蒋三俊;;油茶果象虫的防治[J];林业实用技术;1965年09期
10 牟发章;油茶果综合开发价值高[J];农机具之友;1997年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘大为;李旭;谢方平;蒋蘋;;湖南油茶果采摘机械现状及其关键技术分析[A];中国农业工程学会2011年学术年会论文集[C];2011年
2 高翔;孔令伟;涂艳阳;金志刚;李葆明;金玫蕾;景乃禾;;脑功能新基因的筛选、鉴定及功能研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
3 朱忠芳;;省会旅游中心城市功能研究——以福州市为例[A];中国地理学会2007年学术年会论文摘要集[C];2007年
4 李桂英;邢苗;胡波;;多头绒泡菌类PSTAIRE CDK蛋白的细胞内定位和功能研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
5 张勇;李水生;刘云;刘晓春;林浩然;;鱼类Kisspeptin和GnIH基因起源、进化与功能研究[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年
6 蒲若蕾;黄威权;姬秋和;;胰腺促性腺激素释放激素(CnRH)受体的定位及功能研究[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
7 刘光清;赵伟;;Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)元件结构与功能研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
8 潘敏慧;杜娟;张金叶;孙志亚;黄淑静;于子舒;鲁成;;家蚕Flap Endonuclease-1基因的克隆及功能研究[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
9 高洪深;杨宏志;;工业企业投入产出分析的功能研究[A];企业发展与系统工程——中国系统工程学会第七届年会论文集[C];1992年
10 刘书逊;安华章;于益艺;李楠;陈涛涌;林乃松;王闻雅;曹雪涛;;3种新型泛素样分子的克隆、真核表达、结构分析和功能研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 廖植斌;永兴规范油茶果采摘秩序[N];中国绿色时报;2009年
2 常德市林科所;油茶采摘要适宜[N];常德日报;2011年
3 涟源市农业局 李家友;油茶果采摘有讲究[N];湖南科技报;2002年
4 尹维万;油茶果切莫过早采收![N];湖南科技报;2003年
5 本报记者 徐德清 通讯员 郭德望;“铁成一号”是怎样炼成的[N];常德日报;2011年
6 本报记者 黄燕 通讯员 兰强 杨昌长;不老村“不老”[N];福建日报;2011年
7 记者 胡德桂;油茶果子大如桃 一株打油一斤多[N];常德日报;2006年
8 伍端平;油茶要适时采摘[N];福建科技报;2006年
9 伍端平;油茶适时采摘好处多[N];云南科技报;2005年
10 龚德明;油茶产区为何难觅茶油香[N];人民政协报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 包梅荣;油茶种子成熟调控蛋白基因的分离克隆及功能研究[D];中南林业科技大学;2010年
2 孙照刚;传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组[D];中国农业大学;2005年
3 唐茹琦;精神分裂症相关基因的连锁不平衡分析和功能研究[D];上海交通大学;2008年
4 李明玉;硬骨鱼类IGF信号通路两个重要基因的结构和功能研究[D];中国海洋大学;2010年
5 于丽;纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因治疗大肠癌的实验研究[D];中南大学;2009年
6 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
7 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
8 金哲秀;RNA干扰抑制基质金属蛋白酶对小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究[D];吉林大学;2011年
9 崔晓艳;马铃薯Y病毒属编码的膜相关蛋白的功能研究[D];西北农林科技大学;2010年
10 李建华;髓样细胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究[D];复旦大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张小刚;H19/IGF2印迹模型中miR-483和miR-675功能研究[D];山东师范大学;2011年
2 郭传真;油茶果皮籽分离装置的设计与试验研究[D];华中农业大学;2011年
3 刘银辉;油茶果采摘机虚拟样机设计及动力学分析[D];中南林业科技大学;2012年
4 邹锋;攸县油茶生殖生物学研究[D];中南林业科技大学;2010年
5 许洋;不同栽培区域长林无性系油茶籽品质的研究[D];河北农业大学;2010年
6 肖彦山;经济法基本原则及其功能研究[D];郑州大学;2001年
7 黄勇;Ecoli YggG功能与其相互作用因子研究[D];第四军医大学;2004年
8 宋清华;我国高等学校校训类型及其功能研究[D];苏州大学;2006年
9 苏改联;中文时尚杂志中语码转换的结构与功能研究[D];重庆大学;2006年
10 周华;肺炎链球菌DHBPs的结构和功能研究[D];重庆医科大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026