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《中南林业科技大学》 2010年
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香椿有效成分的提取纯化和生物活性研究

陈丛瑾  
【摘要】:以有效综合利用香椿资源为出发点,比较研究了香椿芽挥发油的提取方法,香椿芽、叶的挥发性成分的快速检测方法,不同产地、月份、不同部位香椿油的成分和活性;结合香椿叶提取物不同极性成分群的活性跟踪分析了乙酸乙酯部位的部分化学成分;测定了香椿的微量元素;比较研究了香椿叶总黄酮的测定、提取、纯化方法;研究了香椿芽挥发油和总黄酮的联合提取方法等。主要研究结果如下: (1)采用超临界C02萃取、超声波辅助乙醚萃取、微波辅助乙醚萃取微波水蒸气蒸馏4种方法提取香椿芽挥发油并用气相色谱-质谱(GC-MS)方法分析比较其化学成分时,各萃取方法得到的挥发油的得率、外观和化学组成存在差异:其中,超临界流体C02萃取精油得率最高(13.3 mL·kg-1),颜色和香味仅次于微波水蒸气蒸馏萃取法(得率3.1 mL·kg-1)。 (2)用顶空微固相萃取(HS-SPME)/GC-MS法分析比较了香椿芽和香椿叶的挥发性化学成分,从香椿芽、叶中分别鉴定出26和46个成分,占各自挥发性组分总质量的74.86%和91.20%(质量分数,下同),主要成分都是β-石竹烯,分别为10.12%和46.87%。该法用于香椿挥发性化学成分检测,方便快捷。 (3)用同时蒸馏萃取(SDE)/GC-MS法分析比较了不同产地、月份香椿叶片精油,不同产地、月份香椿叶轴精油,同一产地、月份、不同部位香椿精油;发现精油的提取率都不同,其中广西南丹8月产香椿叶片精油提取率最高,为7.33 mL·kg-1;所得精油的化学组成也存在差异,但都以倍半萜类化合物为主要组分。 (4)用水蒸气蒸馏(HD)/GC-MS法分析比较了广西南宁11月产香椿叶片、叶轴和香椿皮挥发性物质的化学组成。结果它们的化学组成存在差异,但都含有9种相同的化合物(主要是倍半萜含氧化合物),且各组分的含量有差异 (5)在活性跟踪的指导下对香椿叶提取物的乙酸乙酯部位进行了分离纯化,通过常压硅胶柱层析,重结晶,葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析等方法,分离得到7个化合物。运用化学定性,IR、UV、LC-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR波谱解析和与文献对照等方法,鉴定它们分别是东莨菪素(Ⅰ),山柰酚(Ⅱ),没食子酸乙酯(Ⅲ),槲皮素(Ⅳ),没食子酸(Ⅴ),芦丁(Ⅵ),槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷(Ⅶ)。 (6)用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES法)同时测定不同月份香椿不同部位中的Fe、Mn、Cu、Zn、Ca、Mg、Na、K、Al、Pb、Cd、和Ni 12种元素的含量,方法的加标回收率为93.6%~109.0%,相对标准偏差RSD为0.51%~4.87%。该法测定结果表明香椿中含有丰富的Ca、Mg、Fe、Zn和K等元素,Na、Mn、Cu的含量也相对丰富,且各元素的含量随月份及部位变化而变化。 (7)建立了香椿叶总黄酮含量的AlCl3显色分光光度法和NaNO2-Al(NO3)3显色分光光度法的测定方法,结果是前者更适合测定香椿叶提取物黄酮含量。 (8)建立了香椿叶提取物清除DPPH·能力的测定方法,提出以IM50值来评价抗氧化剂的自由基清除能力,IM50的物理意义为:当DPPH·达到50%清除率时,单位质量抗氧化剂所清除DPPH·的质量 (9)以总黄酮提取率和清除DPPH·的IM50为指标,研究、比较了香椿叶总黄酮的超临界CO2提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、酶法辅助提取、半仿生法提取和常规溶剂回流提取六种工艺条件。发现微波法优于酶法,微波法高效、省时,特别适用于香椿叶总黄酮的提取;酶法条件温和,效果较好,提取率高,也适用于提取香椿叶总黄酮。超声提取法和常规溶剂回流法(效果相差小)都次于微波法和酶法,尚可用于提取香椿叶总黄酮;而超临界CO2提取、半仿生提取法总黄酮提取率低,不适合提取香椿叶总黄酮。优化的微波法和酶法提取工艺条件如下: 微波辅助提取工艺条件:香椿叶粉20 g,以料液比1:12(g·mL-1)加入φ(C2H5OH)=70%的乙醇溶液,在磁力搅拌转速1000 r·min-1,80℃下每次提取20 min,提取4次,总黄酮提取率为99.08%,提取物以总黄酮计的清除DPPH·的IM50值为37.107 3g DPPH··g-1黄酮。 酶法辅助提取工艺条件是:25 g香椿叶粉、175 mg纤维素酶和200 mL pH值为4.0的HAc-NaAc缓冲液混匀后,在150 r·min-1的摇床中,50℃下酶解2 h后,加入400 mLφ(C2H5OH)=95%的乙醇在70℃浸提1h,过滤,滤渣加入400 mLφ(C2H5OH)=65%乙醇溶液提取,每次1h,共提取5次,总黄酮提取率为95.00%,提取物以总黄酮计的清除DPPH·的IM50值为28.0907g DPPH··g-1黄酮。 (10)采用超临界和微波联合提取香椿芽有效成分时,超临界CO2萃取香椿油的得率为13.3 mL.kg-1,芽渣微波提取总黄酮的最佳工艺条件:溶剂乙醇溶液浓度φ=50%,1g香椿芽渣用溶剂12mL,提取温度70℃,每次提取时间15min,提取3至4次。在此条件下1g香椿芽渣可提取总黄酮65.1140 mg至72.9344 mg。 (11)研究、比较了X-5树脂纯化、聚乙二醇-硫酸铵双水相富集分离、超滤纯化香椿提取液总黄酮的工艺条件。结果前2种方法效果较好;SCM300杯式超滤器超滤浓缩、纯化香椿提取液黄酮效果不明显。较好纯化方法的工艺条件如下: X-5树脂分离纯化较佳工艺条件为,吸附:室温,流速3 BV/h,溶液处理量6 BV/次,上柱液pH值在5-6;脱附:脱附剂为φ(C2H5OH)=70%乙醇溶液,流速3 BV/h,脱附剂用量6 BV/次。在此条件下,树脂使用1次时,总黄酮的收率达95.5%,总黄酮的纯度由7.2%提高到43.5%;树脂重复使用5次时,总黄酮的收率仍达80%以上,总黄酮的纯度可由7.2%提高到20%以上。 聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取的适宜工艺条件为:在8 mL黄酮浓缩液中,加入2.5 g聚乙二醇,2.5 g硫酸铵,在自然pH值(5.35),不断振摇下40℃分相3 h。在此条件下,浓缩液的黄酮浓度从3238.011 mg-1提高到4024.036 mg·L-1(上相),总黄酮的收率达99.92%,分配系数为1406.564。 (12)采用管碟法测得香椿叶提取物不同极性部位对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑制作用,对青霉和油茶炭疽菌的抑菌活性小。乙酸乙酯部位对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的活性最强,最低抑菌浓度(MIC)分别为0.3 mg.mL-1和0.6 mg.mL-1,最低杀菌浓度(MBC)都为0.6 mg.mL-1。其次是S-8树脂吸附部位,MIC和MBC都为0.8 mg.mL-1。正丁醇部位抑制青霉和油茶炭疽菌的活性最强,MIC和MB C都为7.1 mg.mL-1。 采用喷雾法和浸虫法测试香椿叶提取物及其不同极性溶剂萃取部位在总固物浓度为10 mg.mL-1时对小菜蛾、斜纹夜蛾和烟蚜的杀虫活性低。不同极性部位对小菜蛾3龄幼虫在72 h内没有杀虫效果;叶片提取物乙酸乙酯部位对斜纹夜蛾2龄幼虫杀虫活性最高,处理72 h后死亡率为44%;叶片提取物正丁醇部位对烟蚜无翅孤雌成蚜杀虫活性最高,处理48 h后死亡率为23.6%。 采用分光光度法测得香椿叶提取物及其不同极性萃取部位都有一定的DPPH·的清除能力,但能力不同。香椿叶片和叶轴都是乙酸乙酯部位对DPPH·的清除能力最强,其次是90%乙醇提取物,再其次是正丁醇部位,且这三个部位都是叶轴对DPPH·的清除能力比叶片强。 (13)采用管碟法测得广西南丹和东南8月产香椿叶片、广西东南8月产叶轴精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、油茶炭疽菌都具有显著的抑制作用,对供试细菌的抑菌圈直径为26 mm-60 mm,对供试真菌的抑菌圈直径为11 mm-50 mm。香椿叶3个油样对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC和MBC都小于0.03125%,对青霉的MIC都为0.2500%,MBC都为0.5000%,对油茶炭疽菌的MIC都为0.06250%,MBC都为0.2500%。 香椿精油对DPPH·的清除能力弱。
【学位授予单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R284.1

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【引证文献】
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中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 孙燕明;蜂胶产品黄酮含量并非越高越好[N];中国消费者报;2010年
2 张继民 钟仕安;科学家采用新法培育银杏,5年即能结果[N];新华每日电讯;2006年
3 赵向南;仲济学选育出南北四季栽种网纹甜瓜[N];山西日报;2007年
4 杜吟;点叶成金银杏茶[N];中国质量报;2007年
5 富业;种出“人参”当菜吃[N];江苏农业科技报;2007年
6 ;血压高冬季形势更严峻[N];健康时报;2006年
7 记者 陈熹、实习生 吕禹、通讯员 彭泉、张宝庆、陈汉梅;科技功臣喜获嘉奖[N];湖北日报;2005年
8 本报记者 谢玲;我国特色资源苦荞功能原料宝藏正待发掘[N];中国食品报;2008年
9 郭胜民 范晓雯;高新技术在中药生产中的应用[N];中国医药报;2000年
10 陈蜜;一天一个苹果,医生远离我[N];医药养生保健报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孟庆焕;牡丹种皮黄酮提取分离与抗氧化及抗疲劳作用研究[D];东北林业大学;2013年
2 叶新福;不同基因型稻米营养保健品质及其利用技术研究[D];福建农林大学;2009年
3 刘红;益智的抗氧化作用及成分研究[D];华南理工大学;2006年
4 杨培民;白花蛇舌草抗肿瘤有效部位黄酮和多糖的纯化及其脂质体复合物的研究[D];北京中医药大学;2011年
5 刘秀波;黄芪次生代谢途径调控诱导子筛选及转录组学研究[D];东北林业大学;2013年
6 胡赛因·默罕默德·克莱迪;[D];华中农业大学;2010年
7 许锋;银杏GbPAL和GbANS基因的克隆与表达及ALA对类黄酮含量的影响[D];山东农业大学;2008年
8 姚晓琳;锦橙皮中多甲氧基黄酮抑菌抗氧化活性研究[D];华中农业大学;2010年
9 刘悦秋;异株荨麻引种栽培及可利用价值研究[D];北京林业大学;2007年
10 张彧;红薯茎叶提取物生物活性及与其化学成分关系的研究[D];南昌大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田小丽;~(60)Co—γ射线辐照诱发苦荞突变体筛选高黄酮含量的种质资源及其品质的综合评价[D];山西农业大学;2003年
2 李林;干旱胁迫对益母草总生物碱和黄酮含量的影响[D];东北林业大学;2009年
3 张若鸿;绿色木霉液体发酵对大青叶中功能成分影响研究[D];河北农业大学;2006年
4 贾雪峰;苦荞麦叶黄酮提纯及其功能活性研究[D];西南大学;2007年
5 张磊;紫茎泽兰矿质营养元素变化动态、次生代谢及其入侵对土壤养分影响的研究[D];西南大学;2008年
6 冯宗帅;青钱柳叶总黄酮提取分离及抗氧化、抗菌研究[D];南京林业大学;2009年
7 刘永刚;雪莲细胞培养及其次生代谢产物黄酮的代谢调控[D];中国农业大学;2005年
8 张孟琴;三叶木通果皮中果胶和黄酮的提取分离研究[D];湖南农业大学;2007年
9 樊林花;苦荞突变体生物黄酮与部分农艺性状的遗传分析[D];山西农业大学;2005年
10 许锋;银杏查尔酮合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表达[D];华中农业大学;2005年
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