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《中南林业科技大学》 2010年
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黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族的克隆及其RNAi载体的构建

樊绍刚  
【摘要】:植物冷胁迫相关蛋白是指从耐寒物种中分离得到的参与调节植物抗寒生理生化活动的特殊蛋白质,其中一类能抑制冰晶形成的蛋白质被称为植物抗冻蛋白。植物抗冻蛋白能结合于冰晶表面,阻止冰晶生长,非依数性地降低溶液冰点而不降低熔点,导致熔点与冰点之间出现差值,即表现为热滞(Thermal hysteresis, TH)活性,还可抑制冰晶之间发生重结晶,即重结晶抑制(Recrystallization inhibition, RI)活性。与昆虫和鱼类抗冻蛋白相比较,植物抗冻蛋白的热滞活性极低,却具有极高的重结晶抑制活性,因此,植物抗冻蛋白亦被称为重结晶抑制蛋白(Ice Recrystallization inhibition Protein, IRIP)。不同物种来源的植物重结晶抑制蛋白差异较大,基因序列之间的相似性很低,其作用机理至今未完全解析清楚。多年生黑麦草是耐寒性极强的常绿植物,内含活性较高的IRIP,应用前景较大。为探索黑麦草IRIP的遗传特性,对IRIP基因家族进行了克隆与功能分析研究。本论文的主要研究结果如下: (1)黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族的克隆。根据GenBank公布的黑麦草重结晶抑制蛋白的序列,以黑麦草基因组为模板,分别设计4对特异引物扩增完整基因组DNA序列;将冷诱导黑麦草叶片总RNA逆转录成cDNA第一链,以此为模板,分别设计4对特异引物扩增黑麦草IRIP的cDNA序列。将获得的4条基因组DNA序列和4条cDNA序列分别克隆至T载体,经测序及序列分析,发现IRIP基因家族序列存在着转录后的编辑剪接,令LpIRIPl失去15个碱基的内含子或是5个氨基酸序列,也导致LpIRIP4基因读码框移位,没有终止子。序列比对结果表明,4个成员碱基序列的3’端高度保守,而5’端的保守性很低,序列相似性低。 (2)黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族的原核表达。根据所克隆的黑麦草重结晶抑制蛋白的cDNA序列,分别设计4对原核表达引物,扩增出4条目的序列,分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和pET-30a,酶切鉴定后转化表达菌株BL32(入DE3),使用终浓度1mM的IPTG进行诱导表达,结果表明,仅第3号成员的表达质粒pET-30a-IRIP3获得成功表达,蛋白质大小为26kDa。 (3)黑麦草重结晶抑制蛋白的双元RNA干扰载体构建。以黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族4条序列及黑麦草抗冻蛋白基因LpAFP (AJ277399)的保守区序列作为干扰目的序列,分别以LpAFP, LpIRIP2, LpIRIP3为模板设计引物,扩增得到400bp左右的干扰装载片段,分别以正反向装载至沉默载体中间载体pBlueActin,后亚克隆至双元载体pCAMBIA2301,构建完成黑麦草IRI蛋白基因家族双元沉默载体,为后续通过RNA沉默技术分析黑麦草IRIP基因家族各个成员的功能奠定了基础。
【学位授予单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S543.6

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